二氢青蒿酸脱氢酶AaDHAADH突变体及其应用

本发明涉及生物合成领域，具体涉及一种二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体及其应用。

背景技术：

1、黄花蒿(artemisia annua l.)为菊科蒿属一年生草本植物，是抗疟疾药物art的唯一天然来源。2001年，世界卫生组织(world health organization,who)确定以art为基础的联合疗法是治疗急性疟疾的最佳选择，随着研究的不断深入，发现art同时具有抗肿瘤、抗炎和免疫调节等多种药理学作用，使得art的市场需求逐渐增加。但art在黄花蒿中的含量极低(0.01-1.00％，干重)，且化学全合成art具有过程复杂、产量低、环境污染严重等缺点，所以art的市场供应问题一直备受关注。

2、由于art的终端生物合成途径未被阐明，仍然不能采用合成生物学的方法直接在微生物中异源合成art。前期研究在黄花蒿植株中发现了一个二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh(专利号：zl202311110316.1)可以催化青蒿酸(artemisinic acid,aa)和二氢青蒿酸(dihydroartemisinic acid,dhaa)的相互转化，为采用合成生物学方法直接生产art的前体化合物dhaa提供了一种快速、便捷的方法。

3、已有研究关于采用半合成法生产art的报道主要分为三个步骤：①采用合成生物学的方法在微生物体系中构建高产aa的底盘菌株，异源合成aa；②以aa为起始物，采用化学合成的方法生成dhaa；③dhaa自动氧化生成art。二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh的发现可以直接在微生物体系中构建产dhaa的底盘菌株，异源合成dhaa，但原始二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh是一个双功能酶，即可以催化aa氧化生成dhaa，又可以催化dhaa还原生成aa，所以直接采用原始二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh去构建产dhaa的底盘菌株时产量较低。为克服这一难题，本发明通过分子对接和定点突变技术对二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh进行定向优化，以提高其催化aa生成dhaa的催化活性，对于采用合成生物学法生产art的前体化合物dhaa具有重要的研究意义。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体及其应用。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体，所述突变体是在seq id no.1所示的氨基酸序列基础上发生的突变，所述突变的位点为第26位的脯氨酸。

4、进一步地，所述突变是将第26位的脯氨酸(proline,p)突变为丝氨酸(serine,s)、蛋氨酸(methionine,m)、苏氨酸(threonine,t)、色氨酸(tryptophan,w)、谷氨酸(glutamicacid,e)、组氨酸(histidine,h)、甘氨酸(glycine,g)、丙氨酸(alanine,a)、缬氨酸(valine,v)、亮氨酸(leucine,l)或异亮氨酸(isoleucine,i)中的至少一种。

5、更进一步地，本发明所述二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体的氨基酸序列如下：

6、(1)seq id no.2所示的氨基酸序列：突变位点为p26s；

7、(2)seq id no.3所示的氨基酸序列：突变位点为p26m；

8、(3)seq id no.4所示的氨基酸序列：突变位点为p26t；

9、(4)seq id no.5所示的氨基酸序列：突变位点为p26w；

10、(5)seq id no.6所示的氨基酸序列：突变位点为p26e；

11、(6)seq id no.7所示的氨基酸序列：突变位点为p26h；

12、(7)seq id no.8所示的氨基酸序列：突变位点为p26g；

13、(8)seq id no.9所示的氨基酸序列：突变位点为p26a；

14、(9)seq id no.10所示的氨基酸序列：突变位点为p26v；

15、(10)seq id no.11所示的氨基酸序列：突变位点为p26l；

16、(11)seq id no.12所示的氨基酸序列：突变位点为p26i。

17、第二方面，本发明提供一种dna分子，所述dna分子编码上述任一种二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体。

18、进一步地，所述dna分子的序列为seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16、seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20、seq idno.21、seq id no.22和seq id no.23所示的碱基序列。

19、第三方面，本发明提供一种重组质粒，所述的重组质粒含有上述任一种dna分子。

20、第四方面，本发明提供一种重组表达宿主细胞，所述的重组表达宿主细胞为原核或真核表达系统且包含上述的重组质粒。

21、进一步地，所述的重组表达宿主细胞包括大肠杆菌或酿酒酵母菌。

22、第五方面，本发明还提供了上述二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体在构建产二氢青蒿酸dhaa底盘菌株中的应用。

23、优选地，将二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体p26l的dna分子被整合到产aa的酿酒酵母底盘菌株的基因组中，通过在相应缺陷型的ynb培养基中筛选得到产dhaa的酿酒酵母底盘菌株dhaa-1。

24、本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：

25、本发明首先采用分子对接软件auto dock tools-1.5.6分别对二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh与底物青蒿酸(artemisinic acid,aa)和dhaa的结合进行分子动力学模拟，得出二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh催化aa生成dhaa的关键氨基酸残基为26位的脯氨酸(proline,p)。然后采用定点突变技术对p26进行定点突变得到多个突变体，通过定向优化发现突变体与原始aadhaadh相比其催化aa氧化生成dhaa的催化活性显著增强，同时催化dhaa还原生成aa的活性显著降低，起到较好的定向优化作用。把定向优化的突变体整合到产aa的酿酒酵母底盘菌株的基因组中，得到产dhaa的底盘菌株，其dhaa的产量明显提高，为采用合成生物学方法大规模生产art的前体化合物dhaa提供了一种更快速、高效的方法。

技术特征：

1.一种二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体，其特征在于，所述突变体是在seq id no.1所示的氨基酸序列基础上发生的突变，所述突变的位点为第26位的脯氨酸。

2.根据权利要求1所述的二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体，其特征在于，所述突变是将第26位的脯氨酸突变为p26s、p26m、p26t、p26w、p26e、p26h、p26g、p26a、p26v、p26l或p26i中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体，其特征在于，所述的二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体的氨基酸序列如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10、seqid no.11或seq id no.12所示。

4.一种dna分子，其特征在于：所述dna分子编码权利要求1-3任一项所述的二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体。

5.根据权利要求4所述的dna分子，其特征在于：所述dna分子的序列为seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16、seq id no.17、seq id no.18、seq idno.19、seq id no.20、seq id no.21、seq id no.22和seq id no.23所示的碱基序列。

6.一种重组质粒，其特征在于：所述的重组质粒含有权利要求4或5所述的dna分子。

7.一种重组表达宿主细胞，其特征在于：所述的重组表达宿主细胞为原核或真核表达系统且包含权利要求6所述的重组质粒。

8.根据权利要求7所述的重组表达宿主细胞，其特征在于：所述的重组表达宿主细胞包括大肠杆菌或酿酒酵母菌。

9.根据权利要求1-3任一项所述的二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体在构建产二氢青蒿酸dhaa底盘菌株中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述二氢青蒿酸脱氢酶aadhaadh突变体为p26l。

技术总结本发明公开了一种二氢青蒿酸脱氢酶AaDHAADH突变体及其应用，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上发生的突变，所述突变的位点为第26位的脯氨酸。本发明将二氢青蒿酸脱氢酶通过分子对接和定点突变技术获得多个突变体，通过定向优化发现突变体与二氢青蒿酸脱氢酶相比具有明显提高的催化活性，为采用合成生物学方法大规模生产ART的前体化合物DHAA提供了一种更快速、高效的方法。技术研发人员：朱建华,郭子正,于荣敏受保护的技术使用者：暨南大学技术研发日：技术公布日：2024/11/14