一种食源性细菌检测试剂盒及其制备方法与应用

本发明涉及微生物检测，尤其涉及了一种食源性细菌检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术：

1、由食源性致病菌污染引起的食源性疾病是是全球共同关注的重大问题。根据世界卫生组织的数据，每年约有6亿人因食用污染的食物患病，由微生物污染引起的病例超过40％；每年约有1.5亿腹泻病例，其中约70％与食源性疾病有关，对人体健康造成很大伤害。作为“金标准”的生化培养法是现行国标采用的方法，但它操作繁琐、耗时。此外，现有的快检技术虽在测试时间上有所缩减，但往往依赖于耗时的预增菌等前处理步骤以实现低丰度样品的检测，总体检测时间仍无法有效缩减。

2、申请公告号为cn 109777855 a的中国发明专利，公开了一种快速检测食源性细菌的方法，该申请的食源性细菌的检测试纸利用带色的水凝胶与纯色的试纸相结合，在测试时，由于食源性细菌的存在，带色水凝胶会被食源性细菌吞噬，试纸显示本色，进而可以得到待测物品是否被细菌污染的结论。但是该检测方法所需的检测时间仍然较长。

3、申请公布号为cn 115825437 a的中国发明专利，公开了一种基于化学交联微针贴片的食源性细菌检测试剂盒及其使用方法。该试剂盒包括一种具有细菌高效捕获能力的微针贴片，通过表面共价结合的目标菌的特异性核酸适配体，作为样品前处理方法，实现目标菌的选择性捕获与分离，结合pcr技术，实现食品中目标细菌的检测。但是该检测方法检测步骤繁琐，且灵敏度不高。

4、因此，开发一种兼具灵敏和便捷特性的食源性细菌检测技术成为了迫切需要。

技术实现思路

1、为解决上述问题，第一方面，本发明提供了一种食源性细菌检测试剂盒，该检测试剂盒灵敏度高、检测速度快且特异性强。

2、本发明解决上述问题的技术方案如下：

3、一种食源性细菌检测试剂盒，包括：表面修饰有目标菌的特异性核酸适配体apt-1的微针贴片、表面修饰有目标菌的特异性核酸适配体apt-2的试剂a、用于显色反应的试剂b以及洗涤液。

4、作为优选，所述微针贴片的溶胀率不低于30％；所述微针贴片能承受的压力不低于10n。

5、所述微针贴片需要具有较好的溶胀性能，在食品基质中捕获目标菌后可以保持完整的微针形态，以便于后续定量检测。

6、所述微针贴片需要具有较好的机械性能，在食品基质中快速捕获目标菌时可以稳定保持完整的微针形态，以便于后续与试剂b进行显色反应。

7、作为优选，所述试剂a为含具有类过氧化物酶活性的物质的溶液经过化学共价修饰核酸序列制成。

8、作为优选，所述具有类过氧化物酶活性的物质选自金属有机框架、金属纳米颗粒、金属氧化物中的一种或多种。

9、本申请中，具有类过氧化物酶活性的金属有机框架、金属纳米颗粒、金属氧化物，是一类兼具纳米材料性能和催化功能的人工模拟酶，也称为纳米酶。纳米酶具有灵敏度高、催化效果好等特点，在分析传感领域可用于提高检测系统的灵敏度，从而实现高灵敏可视化分析。

10、作为优选，所述试剂b为在具有类过氧化物酶活性的物质存在情况下，可与过氧化物发生氧化还原反应的显色底物溶液。

11、微针贴片表面结合有可选择性捕获目标细菌的特异性核酸适配体apt-1，可以选择性地捕获目标细菌，实现快速分离提取的效果。试剂a具有提高灵敏度、放大信号的功能，试剂a中的纳米酶表面修饰有核酸适配体apt-2，可有效与微针贴片上的细菌结合，此时两条核酸适配体形成的夹心结构，具有较好的特异性。此外，试剂a利用纳米酶的特性催化底物试剂b，使试剂b快速显色，提升检测灵敏度。

12、作为优选，所述洗涤液选自生理盐水、超纯水，ph为6～9的磷酸缓冲液、te缓冲液中的一种或多种。

13、第二方面，本发明还提供了上述食源性细菌检测试剂盒的制备方法。

14、其中，食源性细菌检测试剂盒中的微针贴片的制备方法为：提供一微针贴片，将所述特异性核酸适配体apt-1通过共价结合方式修饰到所述微针贴片上。

15、作为优选，所述特异性核酸适配体apt-1经1-(3二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化后与微针贴片共价结合。

16、进一步优选，将所述微针贴片与含有核酸适配体apt-1、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合溶液反应时间为10～30min。

17、进一步优选，所述反应时间为10～20min。

18、作为优选，所述适配体apt-1浓度为0.01～100μm。

19、进一步优选，所述适配体apt-1浓度为0.05～0.5μm。

20、食源性细菌检测试剂盒中的试剂a的制备方法，包括以下步骤：将所述特异性核酸适配体apt-2与含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的磷酸缓冲液活化、离心后分散于含具有类过氧化物酶活性的物质的溶液中反应，离心取沉淀分散于磷酸缓冲液中，得到试剂a。

21、作为优选，所述适配体apt-2浓度为0.01～5μm。

22、第三方面，本发明还提供了上述食源性细菌检测试剂盒的应用，可以应用于检测样品中的食源性细菌。

23、第四方面，本发明还提供了上述食源性细菌检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

24、s1、将所述微针贴片扎入待测样品表面t1时间；取下微针，用洗涤液反复冲洗；

25、s2、将s1中冲洗后的微针贴片浸泡在试剂a中t2时间，并用洗涤液反复冲洗；

26、s3、将s2中冲洗后的微针贴片浸泡在试剂b中t3时间，进行吸光值的测定，并与用标准菌液制备的标准曲线对应，计算得到样品中的食源性细菌含量。

27、作为优选，所述t1为1～5min，t2为10～20min，t3为10～20min。

28、本发明具有以下有益效果：

29、(1)本发明的食源性细菌检测试剂盒，包括表面修饰有目标菌的特异性核酸适配体apt-1的微针贴片，微针贴片可以选择性地捕获目标细菌，实现快速分离提取的效果，此外使用微针贴片提取目标菌，可不需要复杂的前处理即可用于后续检测，操作简便，从而缩短整体检测过程的时间，提升了试剂盒的实用性；

30、(2)本发明的食源性细菌检测试剂盒，还包括表面修饰有目标菌的特异性核酸适配体apt-2的试剂a，核酸适配体apt-1与apt-2形成夹心结构，提升了检测的特异性；此外，试剂a利用纳米酶的特性催化底物试剂b，使试剂b快速显色，提升了检测灵敏度。

技术特征：

1.一种食源性细菌检测试剂盒，其特征在于，包括：表面修饰有目标菌的特异性核酸适配体apt-1的微针贴片、表面修饰有目标菌的特异性核酸适配体apt-2的试剂a、用于显色反应的试剂b以及洗涤液。

2.根据权利要求1所述的一种食源性细菌检测试剂盒，其特征在于，所述微针贴片的溶胀率不低于30％；所述微针贴片能承受的压力不低于10n。

3.根据权利要求1所述的一种食源性细菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂a为含具有类过氧化物酶活性的物质的溶液经过化学共价修饰核酸序列制成。

4.根据权利要求3所述的一种食源性细菌检测试剂盒，其特征在于，所述具有类过氧化物酶活性的物质选自金属有机框架、金属纳米颗粒、金属氧化物中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种食源性细菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂b为在具有类过氧化物酶活性的物质存在情况下，可与过氧化物发生氧化还原反应的显色底物溶液。

6.根据权利要求1所述的一种食源性细菌检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液选自生理盐水、超纯水、ph为6～9的磷酸缓冲液、te缓冲液中的一种或多种。

7.权利要求1～2任一项所述的微针贴片的制备方法，其特征在于，提供一微针贴片，将所述特异性核酸适配体apt-1通过共价结合方式修饰到所述微针贴片上。

8.权利要求1或3任一项所述的试剂a的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述特异性核酸适配体apt-2与含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的磷酸缓冲液活化、离心后分散于含具有类过氧化物酶活性的物质的溶液中反应，离心取沉淀分散于磷酸缓冲液中，得到试剂a。

9.权利要求1～6任一项所述的食源性细菌检测试剂盒在检测食源性细菌中的应用。

10.权利要求1～6任一项所述的食源性细菌检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种食源性细菌检测试剂盒及其制备方法与应用，试剂盒包括：表面修饰有目标菌的特异性核酸适配体Apt‑1的微针贴片、表面修饰有目标菌的特异性核酸适配体Apt‑2的试剂A、用于显色反应的试剂B以及洗涤液。微针贴片表面结合有可选择性捕获目标细菌的特异性核酸适配体Apt‑1，可以选择性地捕获目标细菌，实现快速分离提取的效果。试剂A具有提高灵敏度、放大信号的功能，试剂A中的纳米酶表面修饰有核酸适配体Apt‑2，可有效与微针贴片上的细菌结合，此时两条核酸适配体形成的夹心结构，具有较好的特异性。此外，试剂A利用纳米酶催化底物试剂B，使试剂B快速显色，提升检测灵敏度。技术研发人员：李欢,王彦波,侯文娜,陈剑,范潜威受保护的技术使用者：浙江工商大学技术研发日：技术公布日：2024/11/14