一种用于检测全血及组织中人GLP-1和FGF21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞含量的方法与流程

本发明涉及细胞含量检测方法，具体涉及采用实时荧光定量pcr法分析全血和组织中的人glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞含量。

背景技术：

1、为了解决当前糖尿病的临床治疗模式单一，效果不佳的现状，本申请人基于间充质干细胞治疗疾病的广泛研究成果，创新性的将glp-1和fgf21导入自体脂肪间充质干细胞，如201810283803.0和202010180799.2，得到针对2型糖尿病的细胞治疗产品。

2、为了探索glp-1和fgf21双因子修饰的自体脂肪间充质干细胞治疗2型糖尿病的细胞治疗产品安全性、有效性和稳定性的评估体系，确保使用检测方法进行生物样本分析所得结果的准确性和可靠性，本申请发明人对于glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞含量检测方法进行探究。

技术实现思路

1、本发明采用实时荧光定量pcr法分析edta抗凝全血和脑、心、脾、肺、肝、肾组织中的人glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞含量，结果表明使用以空白肝组织匀浆液作为稀释液建立标准曲线对其他组织中人glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞浓度的分析方法，其特异性、精密度、准确度、耐用性满足接受标准，从而完成本发明。

2、本发明的目的在于提供一种用于检测全血及组织中人glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞含量的方法，该方法基于实时荧光定量pcr法，以空白肝组织匀浆液作为稀释液建立标准曲线，对全血和其他组织中人glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞浓度进行分析。

3、在本发明方法的验证实施方式中，采用的glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞，为由本申请人在先专利201810283803.0提供的glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞，详见“实施例1”。

4、作为glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞样品，细胞浓度为5×106cells/ml。

5、在本发明方法的验证实施方式中，实时荧光定量pcr法测定全血及组织中人glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞含量，所述组织非限定性地包括来自脑、心、脾、肺、肝和肾的组织。

6、在本发明方法的验证实施方式中，以空白肝组织匀浆液作为稀释液建立标准曲线，标准曲线样本浓度优选在128～400000cells/mg组织，在此浓度范围内，线性度优良，准确度高。

7、在本发明方法的验证实施方式中，包括：(1)建立标准曲线，(2)将空白肝组织制备成组织匀浆液，用其作为稀释液，将受试物稀释为不同浓度的样本，再采用核酸提取试剂盒对其进行核酸提取，(3)以提取后的核酸为模板使用探针法进行实时荧光定量pcr，(4)以样本扩增ct值为纵坐标，样本浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，由扩增获得的ct值代入标准曲线方程获得未知样品的浓度。

8、优选地，所述核酸提取试剂盒为tianamp genomic dna kit核酸提取试剂盒。

9、优选地，所述探针法为taqman探针法。

10、优选地，所述标准曲线方程以基于空白肝组织匀浆液作为稀释液建立标准曲线获得。

11、本发明提供的检测方法具有良好的准确性和可靠性，具体而言：

12、(1)人glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞在肝组织匀浆液中室温放置4hr、2-8℃放置8hr、超低温(低于-70℃)放置118hr可以保持稳定；人glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞在肝组织样本提取的基因组室温放置5.5hr、超低温(低于-70℃)放置333hr及超低温(低于-70℃)反复冻融3个循环可以保持稳定；

13、(2)在128～400000cell/mg组织浓度范围内线性良好；

14、(3)特异性、精密度、准确度、耐用性满足接受标准。

技术特征：

1.一种用于检测全血及组织中人glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞含量的方法，该方法基于实时荧光定量pcr法，以肝组织匀浆液作为稀释液建立标准曲线，对全血和其他组织中人glp-1和fgf21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞浓度进行分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组织非限定性地包括来自脑、心、脾、肺、肝和肾的组织。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，以空白肝组织匀浆液作为稀释液建立标准曲线，标准曲线样本浓度在128～400000cells/mg组织范围内。

4.根据权利要求1所述的方法，包括：

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸提取试剂盒为tianamp genomic dna kit核酸提取试剂盒。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述探针法为taqman探针法。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述标准曲线方程是基于空白肝组织匀浆液作为稀释液建立标准曲线获得的。

技术总结本发明提供了一种用于检测全血及组织中人GLP‑1和FGF21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞含量的方法，该方法基于实时荧光定量PCR法，以肝组织匀浆液作为稀释液建立标准曲线，对全血和其他组织中人GLP‑1和FGF21双因子高表达自体脂肪间充质干细胞浓度进行分析，该方法具有良好的准确性和可靠性。技术研发人员：薛冰华,王艳超,靳丽艳,金新雨受保护的技术使用者：北京吉源生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2