一种聚磷酸激酶突变体、表达该突变体的重组基因工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种聚磷酸激酶突变体、表达该突变体的重组基因工程菌及其应用，属于酶。

背景技术：

1、甘露糖被广泛应用于食品、医药、生物科技等领域，传统方法生产d-甘露糖一般采用植物组织水解法，或者是以d-葡萄糖为原料进行化学合成，化学合成法需要使用化学催化剂，且需要在严格控制温度和酸浓度的条件下进行生产。

2、但是化学法合成d-甘露糖存在能耗大，生产成本高，反应条件苛刻，生产过程中会形成副产物，后续纯化操作复杂等问题。

3、近年来有许多学者开始研究用生物转化的方法来实现甘露糖的绿色生产，生物转化方法是采用酶进行催化反应。现有技术中以葡萄糖为原料多酶催化制备甘露糖，具体过程为葡萄糖在聚磷酸激酶（简称为ppgk酶）催化作用下生成葡萄糖6-磷酸，然后在葡萄糖磷酸异构酶（简称为pgi酶）催化作用下生成果糖6-磷酸，在甘露糖6-磷酸异构酶（简称为m6pi酶）的催化作用下生成甘露糖6-磷酸，最后在甘露糖6-磷酸磷酸酶（简称为m6pp酶）的催化作用下生成甘露糖，其中pgi酶、m6pi酶可以使用双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶（简称为pgi/m6pi酶）代替。

4、现有的野生型ppgk酶在用于甘露糖的生物转化生产时，存在酶活低，进而导致葡萄糖的转化效率较低的问题；野生型ppgk酶的基因构建的重组基因工程菌，对ppgk酶的表达量也较低。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种聚磷酸激酶突变体、表达该突变体的重组基因工程菌及其应用，实现以下发明目的：提高ppgk酶的酶活，提高含ppgk酶突变体基因的重组基因工程菌对ppgk酶的表达水平。

2、为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

3、一种聚磷酸激酶突变体，所述聚磷酸激酶突变体为f45s、v115d或a200d中的一种；所述f45s的氨基酸序列如序列表中seq id no.10所示；所述v115d的氨基酸序列如序列表中seq id no.12所示；所述a200d的氨基酸序列如序列表中seq id no.14所示。

4、所述f45s相较于野生型ppgk酶，氨基酸序列中第45位的苯丙氨酸突变成丝氨酸；所述v115d相较于野生型ppgk酶，氨基酸序列中第115位的缬氨酸突变成天冬氨酸；所述a200d相较于野生型ppgk酶，氨基酸序列中第200位的丙氨酸突变成天冬氨酸。

5、所述f45s的核苷酸序列如序列表中seq id no.9所示；所述v115d的核苷酸序列如序列表中seqid no.11所示；所述a200d的核苷酸序列如序列表中seq id no.13所示。

6、表达所述聚磷酸激酶突变体的重组基因工程菌。

7、所述的聚磷酸激酶突变体在合成甘露糖中的应用。

8、与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

9、1、本发明在野生型ppgk酶的基础上，进行定点突变改变ppgk酶分子结构，获得ppgk酶突变体，提高了ppgk酶的酶活，并构建了含ppgk酶突变体基因的重组基因工程菌，其对ppgk酶的表达水平明显提高。

10、2、本发明所述ppgk酶突变体，在75℃条件下，相对于野生型ppgk酶，具有139.6-160.8％的相对酶活。

11、3、本发明构建的含ppgk酶突变体v115d基因的重组基因工程菌、含ppgk酶突变体a200d基因的重组基因工程菌，相对于含野生型ppgk酶基因的重组基因工程菌，对ppgk酶的表达水平明显提高。

技术特征：

1.一种聚磷酸激酶突变体，其特征在于：所述聚磷酸激酶突变体为f45s、v115d或a200d中的一种；所述f45s的氨基酸序列如序列表中seq id no.10所示；所述v115d的氨基酸序列如序列表中seq id no.12所示；所述a200d的氨基酸序列如序列表中seq id no.14所示。

2.根据权利要求1所述的一种聚磷酸激酶突变体，其特征在于：所述f45s的核苷酸序列如序列表中seq id no.9所示；所述v115d的核苷酸序列如序列表中seq id no.11所示；所述a200d的核苷酸序列如序列表中seq id no.13所示。

3.表达权利要求1-2任一项所述聚磷酸激酶突变体的重组基因工程菌。

4.权利要求1-2任一项所述的聚磷酸激酶突变体在合成甘露糖中的应用。

技术总结本发明提供一种聚磷酸激酶突变体、表达该突变体的重组基因工程菌及其应用，属于酶技术领域，所述聚磷酸激酶突变体为F45S、V115D或A200D中的一种；所述F45S的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.10所示；所述V115D的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示；所述A200D的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.14所示。本发明在野生型PPGK酶的基础上，进行定点突变改变PPGK酶分子结构，获得PPGK酶突变体，提高了PPGK酶的酶活，并构建了含PPGK酶突变体基因的重组基因工程菌，其对PPGK酶的表达水平明显提高。技术研发人员：唐春晖,赵培培,付吉明,刘敏,张治家,柴光臻,张彩云,周晓琳受保护的技术使用者：山东天力药业有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/23