用DNA编码的热通道进行的多重荧光细胞和组织成像及其用途

本发明的领域涉及靶标分子的检测，例如以多重(multiplex)形式。政府支持本发明是在由美国国立卫生研究院资助的gm133052和gm124401以及由美国海军研究办公室资助的n00014-18-1-2549下的政府支持下完成。美国政府对本发明享有某些权利。

背景技术：

1、空间生物学使研究人员能够绘制单个细胞内的空间结构并确定其如何与组织环境中的探测相互作用。在单细胞水平上揭示的空间和定量信息极大地扩展了对人体细胞类型和疾病病变微环境中异质性的理解。测序和成像是原位空间生物学研究的两个主要平台并且可以在不剖解细胞的情况下进行。与测序相比，基于成像的方法可以在完整的生物样品中提供更高的空间分辨率，但通常受患于所分析生物靶标的低多重性。在单细胞和组织中使多种不同种类的生物分子可视化的能力已成为帮助理解复杂生物系统(例如癌症肿瘤环境中的细胞异质性和信号调节途径)的越来越重要的工具(lewis,s.m.等，spatialomics and multiplexed imaging to explore cancer biology.nature methods,1-16(2021))。

2、然而，由于光谱重叠，荧光显微镜术的多重性通常受到调色板(通常为3～4种颜色)的限制。为了克服这一瓶颈，已经开发了更大实体上荧光团的几何编码和成像剂的迭代结合。这种迭代方法需要多轮洗涤以去除前一轮的信号并积累当前轮次的信号，这是通过自动化微流体系统实现的。实验设置通常是复杂的，并且洗涤过程是耗时的。几何编码是在巨型实体上实现的，该实体通常过于庞大，无法原位扩散到亚细胞生物学靶标以揭示单个细胞中的高分辨率空间信息。除此之外，组合编码可应用于迭代结合或光谱编码，以指数级改善多重性(chen,k.h.,boettiger,a.n.,moffitt,j.r.,wang,s.&zhuang,x.rnaimaging.spatially resolved,highly multiplexed rna profiling in singlecells.science348,aaa6090(2015)和eng,c.l.等，transcriptome-scale super-resolvedimaging in tissues by rna seqfish.nature 568,235-239(2019))。

3、因此，本领域仍然需要用于靶标分子(例如蛋白质和rna)的改进的多重检测的试剂和方法。本公开内容满足了这些需求中的一些。

技术实现思路

1、本文所述的方法、组合物和试剂盒部分地基于经标记核酸探针的生成，所述经标记核酸探针具有熔解点/变性温度不同的区域，使得将温度改变为给定的温度通道可以释放对报告分子的抑制，从而允许细胞或组织中给定的核酸的可视化。

2、在一个方面，本文提供了用于对样品中的靶标分子进行检测的方法。所述方法包括提供检测探针组。检测探针组包含至少三条核酸链——靶标结合链、报告链和猝灭链。第一链(也称为靶标结合链)包含用于与靶标结合的靶标结合剂，所述靶标结合剂连接到用于与报告链杂交的杂交结构域。第二链(本文也称为报告链)包含用于与靶标结合链的杂交结构域杂交的第一杂交结构域，所述第一杂交结构域连接到用于与猝灭链结合的第二杂交结构域。报告链进一步包含能够产生可检测信号的报告分子。报告链的第一杂交结构域包含与靶标结合链的杂交结构域的核苷酸序列实质上互补的核苷酸序列。第三链(也称为猝灭链)包含用于与报告链的第二杂交结构域杂交的杂交结构域。猝灭链包含猝灭剂分子。猝灭链的杂交结构域包含与报告链的第二杂交结构域的核苷酸序列实质上互补的核苷酸序列。报告链中的报告分子和猝灭链中的猝灭剂分子被布置成使得当报告链和猝灭链彼此杂交(例如通过杂交结构域)时，猝灭剂分子猝灭来自报告分子的可检测信号。当猝灭链和报告链不彼此杂交时，来自报告分子的可检测信号不被猝灭。

3、靶标结合剂可以选自于由以下组成的组：核酸、蛋白质、肽、拟肽(peptidomimetics)、氨基酸、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂多糖、凝集素、核苷、核苷酸、维生素、类固醇、激素、辅因子、受体和受体配体。在一些实施方式中，靶标结合剂是核酸、抗体、抗体的抗原结合片段、抗体模拟物、受体或受体的配体。例如，靶标结合分子是核酸。在另一个非限制性示例中，靶标结合分子是抗体或抗体的抗原结合片段。

4、靶标分子可以是核酸、蛋白质、糖、脂质、小分子或抗原。在一些实施方式中，靶标分子是核酸。例如，靶标分子是rna、dna或rna和dna的混合物。在一些实施方式中，靶标分子是蛋白质。在一些实施方式中，靶标分子是初级代谢物或次级代谢物。

5、不同杂交结构域的熔解温度不同，以允许从报告链释放大部分猝灭链，而不实质上从靶标结合链释放报告链和/或从靶标分子释放靶标结合链。通常，与报告链杂交的猝灭链的熔解温度(tm)低于与靶标结合链杂交的报告链的熔解温度，并且与报告链杂交的猝灭链的熔解温度低于与靶标分子结合的靶标结合链的熔解温度。通常，与靶标结合链杂交的报告链的熔解温度低于与靶标分子结合的靶标结合剂。

6、在允许通过靶标结合剂与靶标结合而使探针组结合至靶标的条件下使探针组与靶标接触。通过评估作为温度的函数产生的可检测信号来分析探针组对靶标的结合。例如，在高于与报告链杂交的猝灭链的熔解温度且低于与靶标结合链杂交的报告链的熔解温度的温度下检测或测量可检测信号。在高于与报告链杂交的猝灭链的熔解温度但低于与靶标结合的靶标结合剂的熔解温度的温度下，猝灭链和报告链不再彼此杂交，并且来自报告分子的可检测信号不被猝灭。相反，当在低于与报告链杂交的猝灭链的熔解温度的温度下测量可检测信号时，猝灭链和报告链保持彼此杂交并且来自报告分子的可检测信号被猝灭。因此，在两个温度下的可检测信号是不同的。

7、在本文所述的多个方面的一些实施方式中，靶标结合链进一步包含第二杂交结构域。靶标结合链的第二杂交结构域可用于与参考链杂交。参考链包含杂交结构域，所述杂交结构域包含与靶标结合链的第二杂交结构域的核酸链实质上互补的核苷酸序列。参考链还包含能够产生可检测信号的报告分子。与靶标结合链杂交的参考链的熔解温度高于与靶标结合链杂交的报告链的熔解温度。

8、在本文所述任一方面的一些实施方式中，检测探针组包含至少四条核酸链——靶标结合链、报告链、猝灭链和参考链。当使用包含四条链(靶标结合链、报告链、猝灭链和参考链)的检测探针组进行检测时，该方法包括在第一温度和第二温度下检测或测量来自报告分子的可检测信号。第一温度是高于与报告链杂交的猝灭链的熔解温度但低于与靶标结合链杂交的报告链的熔解温度的温度。第二温度是高于与靶标结合链杂交的报告链的熔解温度但低于与靶标结合链杂交的参考链的熔解温度的温度。来自附接到参考链的报告分子的可检测信号的检测可以作为对照或参考。

9、在一些实施方式中，该方法进一步包括在低于与靶标结合链杂交的报告链的熔解温度的温度下检测或测量来自报告分子的可检测信号。

10、可以制备不同的报告链和猝灭链，使得它们具有不同的熔解温度。由于不同的猝灭链和报告链对在不同温度下变性或熔解，因此来自不同报告分子的可检测信号将在不同温度下不猝灭。因此，可以在不同温度下同时评估不同探针组对不同靶标的结合。因此，在另一方面，本文提供了用于靶标分子的多重检测的方法。该方法包括提供多个检测探针组，其中，每个检测探针组包含如本文所述的三条链——靶标结合链、报告链和猝灭链。

11、在多个探针组中，一个检测探针组中与报告链杂交的猝灭链的熔解温度与至少一个另外的探针组中与报告链杂交的猝灭链的熔解温度不同。此外，具有熔解温度较低的第三链的探针组中的第二链的熔解温度与具有熔解温度较高的第三链的探针组中的第二链的熔解温度相比大致相同或低于后者。需要注意的是，一个检测探针组中的猝灭链可能能或不能与所述多个检测探针组中的另一个检测探针组中的报告链杂交。

12、使所述多个检测探针组与靶标分子接触，以允许通过靶标结合剂与靶标的结合而使检测探针组结合至其各自的靶标。通过评估作为温度的函数产生的可检测信号来分析检测探针组对靶标的结合。例如，在高于与报告链杂交的猝灭链的熔解温度且低于与靶标结合链杂交的报告链的熔解温度的温度下测量来自与其靶标结合的第一探针组的可检测信号。该温度使得结合至靶标的第二检测探针组中的猝灭链保持与该第二检测探针组中的报告链杂交。在高于与第二探针组的报告链杂交的第二探针组的猝灭链的熔解温度且低于与第二探针组的靶标结合链杂交的第二探针组的报告链的熔解温度的温度下测量来自与其靶标结合的第二探针组的可检测信号。由于来自不同探针组的可检测信号在不同温度下生成，因此可以区分不同检测探针组对其各自靶的结合，并以多重方式检测靶标。这允许在一个反应中检测多种靶标分子，即多重检测。在一些实施方式中，检测至少两种靶标分子，例如，检测至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或更多种不同的靶标分子。

13、值得注意的是，所述多个检测探针组的不同成员中的报告分子可以相同或不同。因此，在本文所述各个方面的一些实施方式中，所述多个检测探针组中一个检测探针组中的报告分子与所述多个检测探针组中至少一个另外的检测探针组中的报告分子不同。不受理论的束缚，使用不同的报告分子可以提供额外的多重检测能力。例如，可以使用如下的探针组：与报告链杂交的猝灭链的熔解温度相似，但不同探针组具有不同报告分子。来自一个报告分子的可检测信号与来自至少一个报告分子的可检测信号可区分。可区分的可检测信号可以在一个温度下测量以检测不同探针组对其各自靶标的结合，例如，高于与报告链杂交的猝灭链的熔解温度的温度。这允许在一个反应中检测多种靶标分子，即多重检测。在一些实施方式中，检测至少两种靶标分子，例如，检测至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或更多种不同的靶标分子。在一些实施方式中，用包含可区分的报告分子的检测探针组检测每种靶标分子。这些可以与在不同温度下变性或熔解的其它猝灭链和报告链对一起使用以进一步多重化。

14、在另一个方面，本文提供了检测探针组。检测探针组包含如本文所述的至少三条核酸链——靶标结合链、报告链和猝灭链。

15、在又一个方面，本文提供了试剂盒。试剂盒包含如本文所述的检测探针组。在一些实施方式中，试剂盒包含如本文所述的多个检测探针组。

16、值得注意的是，可检测标记的检测可以通过荧光显微术和荧光标记的报告子进行。或者通过比色检测和例如纳米颗粒标记报告子进行。检测还可以用于对原核、真核、其它或混合来源的经固定的细胞、类器官或组织样品中的生物物种进行多重成像。读出也可以在表面(例如玻璃载玻片或其它基底)上进行，例如用于对表面上的经条形码化的珠进行测序或用于对表面上的固定寡核苷酸进行测序以用于核酸数据存储应用。

17、有多种方法可以将样品加热到正确的温度。一种方法是通过peltier台上系统，例如vaheat。另一种方法是让缓冲液连续流过腔室，其中，外部加热器控制缓冲液温度。控制温度的另一种方法是与金属纳米材料耦合的使用激光或光将光转化为热能。参见例如www.cell.com/trends/biochemical-sciences/fulltext/s0968-0004(19)30236-1？dgcid。