引物、DNA检测方法和DNA检测试剂盒与流程

本发明涉及核酸扩增反应、特别是不对称核酸扩增反应中的引物、dna检测方法和dna检测试剂盒。

背景技术：

1、基因检测中有聚合酶链式反应(pcr)和实时pcr、数字pcr等的方法。在能够以高于pcr的精度进行定量的实时pcr和数字pcr中，使用嵌入剂或荧光标记探针检测dna。使用荧光标记探针的dna的检测法中经常使用水解探针和分子信标这2种。水解探针是利用dna聚合酶的核酸酶活性将探针降解，从而荧光色素从探针游离而发出荧光，与这样的水解探针不同，分子信标在游离状态下形成茎环并与检测对象的dna在环部分结合，具有在pcr中不被降解的特征，在pcr后不仅能够进行利用荧光强度判定是否扩增，而且能够进行熔解曲线分析。

2、其中，报道了如下方法：在使用分子信标的dna检测中，为了增加分子信标与扩增得到的检测对象的dna的结合量，并增加荧光强度，以与分子信标互补的链过量扩增的方式，使正向引物和反向引物的浓度不对称，对检测对象的dna进行不对称扩增(非专利文献1)。

3、本发明的发明人开发了如下技术：在数字pcr中应用使用分子信标的不对称核酸扩增反应，在扩增后，通过熔解曲线分析，高灵敏度且高多重性(multiplex)地鉴定对象基因的基因型(专利文献1、非专利文献2)。

4、以下表示数字pcr的检测方法的一例。首先，在经极限稀释的检测体中加入pcr所需要的dna聚合酶、引物、荧光标记探针，制备pcr反应液。将pcr反应液分成孔或液滴等的微小分区，使得此时各分区为装有1分子对象基因或不含对象基因的任一种状态。

5、接着，通过pcr对微小分区内的对象基因进行扩增。在pcr后测定各微小分区的荧光强度，对具有超过阈值的荧光强度的微小分区进行计数，由此能够对对象基因进行定量。

6、如果应用使用分子信标的不对称核酸扩增反应，则在pcr后，进行微小分区内扩增得到的对象基因和分子信标的熔解曲线分析，观察对象基因的每个基因型不同的熔解温度(tm)，能够进行判别。

7、现有技术文献

8、专利文献

9、专利文献1：日本特开2018－108063号公报

10、非专利文献

11、非专利文献1：bmc microbiol.,13,pp295,2013

12、非专利文献2：anal.chem.,92,pp11705-11713,2020

技术实现思路

1、发明所要解决的技术问题

2、然而，本发明的发明人首次认识到在不对称核酸扩增反应中存在如下问题：过量扩增的dna的一个链在分子内形成二级结构，在成为单链结构的区域所设计的分子信标与扩增得到的检测对象dna结合，而在成为双链结构的区域所设计的分子信标产生结合比例降低，荧光强度降低。特别是，在不是如实时pcr这样的在试管内进行的pcr而是如数字pcr这样的在微小分区内进行的pcr的情况下，一旦荧光强度降低，则会成为能够检出的强度以下而无法检测，熔解曲线分析中荧光强度变化相对于温度变化小而无法算出熔解温度，或者无法容易地测量而测量灵敏度和精度下降。

3、因此，本发明的目的在于提供新型的引物、dna检测方法和dna检测试剂盒，通过在不对称核酸扩增反应中降低过量扩增的dna的一个链的分子信标结合区域形成双链结构的比例，增加形成单链结构的比例，抑制分子信标与扩增得到的检测对象的dna的结合比例降低，能够精度好且高灵敏度地检测检测对象基因，进行基因型判别。

4、用于解决技术问题的技术方案

5、本发明的发明人发现，在不对称核酸扩增反应中即使用相同的引物组进行扩增，根据分子信标的结合区域，荧光强度也大幅不同，而且被设计为扩增后的一条链在分子内形成双链结构的区域中分子信标的荧光强度小。由此发现通过在不对称核酸扩增反应中使用的引物中特意导入与对象基因的序列不同的突变，进行不对称核酸扩增反应，分子信标的结合区域形成双链结构的比例降低，荧光强度增加，从而完成了本发明。

6、本发明的一个实施方式是一种靶标核酸的检测方法，其包括：

7、在包含正向引物和反向引物的引物对和探针的存在下，对受检核酸进行扩增的工序；和

8、测定通过上述正向引物和上述反向引物扩增得到的核酸与上述探针的结合的工序，

9、上述正向引物或上述反向引物的任意一方或双方在其序列中包含突变，上述突变用于在上述扩增得到的核酸中导入突变，使得在使上述探针与上述扩增得到的核酸结合的温度下使上述扩增得到的核酸中的探针结合区域的单链形成碱基的比例增大。

10、本发明的另一个实施方式是用于在受检核酸中导入突变并进行扩增的引物，在其序列中包含突变，该突变用于在上述受检核酸中导入突变，使得在使由上述受检核酸扩增得到的核酸与探针结合的温度下使由上述受检核酸扩增得到的核酸中的上述探针的结合区域的单链形成碱基的比例增大。

11、本发明的又一个实施方式是用于检测靶标核酸的试剂盒，其包括：

12、包含正向引物和反向引物的引物对；和

13、能够与使用正向引物和反向引物所扩增的核酸结合的探针，

14、上述正向引物或上述反向引物的任意一方或双方在其序列中包含突变，该突变用于在上述扩增的核酸中导入突变，使得在使上述探针与上述扩增的核酸结合的温度下使上述扩增的核酸中的探针结合区域的单链形成碱基的比例增大。

15、发明的效果

16、根据本发明，可以提供新型的引物、dna检测方法和dna检测试剂盒，在不对称核酸扩增反应中，能够以更高精度且高灵敏度对对象基因进行检测或定量。因此，本发明在基因检测、进行基因型判别等的基础研究、检查、药物研发等的领域中有用。

技术特征：

1.一种靶标核酸的检测方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，包括：

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

14.一种用于在受检核酸中导入突变并进行扩增的引物，其特征在于：

15.如权利要求14所述的引物，其特征在于：

16.如权利要求14所述的引物，其特征在于：

17.一种用于检测靶标核酸的试剂盒，其特征在于，包括：

18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于：

19.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于：

20.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于：

21.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于：

22.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于：

23.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于：

24.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于：

技术总结本发明涉及核酸扩增反应、特别是不对称核酸扩增反应中的引物、DNA检测方法和DNA检测试剂盒。具体而言，涉及用于在受检核酸中导入突变并进行扩增的引物以及使用该引物的DNA检测方法和DNA检测试剂盒，上述引物在其序列中包含突变，该突变用于在上述受检核酸中导入突变，使得在使由上述受检核酸扩增得到的核酸与探针结合的温度下使由上述受检核酸扩增得到的核酸中上述探针的结合区域的单链形成碱基的比例增大。技术研发人员：田中淳子受保护的技术使用者：株式会社日立高新技术技术研发日：技术公布日：2024/12/23