一种杂合贻贝蛋白的构建方法与发酵制备方法

本发明涉及基因工程与蛋白材料领域，具体涉及一种杂合贻贝蛋白的构建方法与发酵制备方法。

背景技术：

1、贻贝足蛋白(mussel foot proteins,mfps)，又称贻贝黏附蛋白，是地中海贻贝(mytilus galloprovincalis)、厚壳贻贝(mytilus coruscus)、翡翠贻贝(perna viridis)等海洋贻贝足丝分泌的黏附物。目前已经发现了6种类型的mfps(mfp-1～mfp-6)，贻贝足蛋白具有粘附范围广、强度高、生物亲和性好等特点，是研究生物湿粘附的重要仿生对象和创新策略的来源。

2、天然贻贝蛋白的提取十分困难，基因工程为贻贝蛋白的生产提供了新的方法，mfps在真核和原核宿主中都实现了异源表达。然而，重组mfps仍然存在一些问题，比如毒性可溶性表达导致的低产量、纯化效率低、溶解度差等等。为了克服这些缺陷，研究人员构建了多种由fp-1、fp-3和fp-5组成的新型杂合贻贝蛋白。蛋白主要表达为包涵体，并且较长的编码序列占用了更多的翻译资源，导致三片段杂合蛋白fp-151、fp-131和fp-353的产量比单一蛋白高，fp-151在200l补料间歇式生物反应器中培养，获得了约为1g/l的重组贻贝蛋白产量，也有研究人员优化了纯化方法获得了纯品率为0.7g/l的fp-151，这是目前已知的最高表达和纯化产量。此外，在不同的二片段融合蛋白fp-33、fp-35、fp-31中，由fp-3和fp-5组成的融合蛋白具有最好的粘附性能，这可能是3型和5型蛋白本身具有优异的粘附力因此在结合后展现出最强粘附力。然而，对于粘附力最为优异的3型和5型蛋白，并未有系列设计融合蛋白且大批量生产的报道。

3、因此，基于贻贝蛋白的多片段杂合，开发一种新的高粘性高产量的贻贝蛋白生产工艺具有重要意义。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种杂合贻贝蛋白及其构建方法和发酵制备方法。本发明采用基因工程技术，构建串联多拷贝贻贝蛋白的质粒，以大肠杆菌为宿主，表达并获得不同系列的杂合贻贝蛋白，提供了上述杂合贻贝蛋白黏附性能对比的方法，提供上述杂合贻贝蛋白的发酵工艺优化，实现高粘性贻贝蛋白的高水平生产。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种杂合贻贝蛋白及其构建方法与发酵制备方法。具体技术方案如下：

3、一种杂合贻贝蛋白，其含有一个3型贻贝蛋白和一个或两个5型贻贝蛋白。优选地，所述的杂合贻贝蛋白为下述a1～a4中的任意一种：

4、a1，从n端到c端依次含有5型贻贝蛋白、3型贻贝蛋白和5型贻贝蛋白(fp-535)；

5、a2，从n端到c端依次含有5型贻贝蛋白、5型贻贝蛋白和3型贻贝蛋白(fp-553)；

6、a3，从n端到c端依次含有3型贻贝蛋白和5型贻贝蛋白(fp-35)；

7、a4，从n端到c端依次含有5型贻贝蛋白和3型贻贝蛋白(fp-53)。

8、其中，所述的3型贻贝蛋白为来源于地中海贻贝mytilus galloprovincalis的3b型蛋白mgfp-3b或mgfp-3b的突变体3bm；所述的地中海贻贝为野生型地中海贻贝。优选地，所述的3bm包括对mgfp-3b进行突变的单突变体和组合突变体，所述的单突变体为g33y、n43y或n76y中的任意一种，所述的组合突变体为两两突变和三三突变获得的g33y/n43y、n43y/n76y、g33y/n76y或g33y/n43y/n76y中的任意一种。进一步优选地，所述的mgfp-3b和3bm的具体氨基酸序列和核苷酸序列详见专利号为cn115181169a的中国专利。更优选地，所述的3型贻贝蛋白为3bm组合突变体g33y/n43y/n76y，其粘附力最佳。

9、所述的5型贻贝蛋白来源于野生型地中海贻贝mytilus galloprovincalis，命名为mgfp-5，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

10、其中，a1～a4所示的杂合贻贝蛋白的氨基酸序列顺序如seq id no.2～5所示，编码基因序列顺序如seq id no.6～9所示。

11、第二方面，本发明提供了一种表达盒或重组表达载体，所述表达盒或表达载体含有第一方面所述的杂合贻贝蛋白的编码基因序列。优选地，所述的重组表达载体为pet28a-mgfp-3b、pet28a-mgfp-3bm(fp-3)、pet28a-mgfp-5(fp-5)、pet28a-mgfp-35(fp-35)、pet28a-mgfp-53(fp-53)、pet28a-mgfp-535(fp-535)、pet28a-mgfp-553(fp-553)或pacycduet-mgfp-535。

12、第三方面，本发明提供了含有第二方面所述的表达盒或重组表达载体的重组大肠杆菌。优选地，所述的重组菌的出发菌为大肠杆菌bl21(de3)。

13、第四方面，本发明提供了第一方面所述的杂合贻贝蛋白的制备方法，包括如下步骤：

14、(1)扩增杂合贻贝蛋白的编码基因序列，导入表达载体中构建重组表达载体；将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中即得重组菌；

15、(2)将所述的重组菌的种子液接种至发酵培养基中发酵培养得到发酵液，将发酵液经提取纯化即得杂合贻贝蛋白。

16、其中，步骤(1)中，所述的表达载体为pet28a、pacycduet-1、petduet-1、prsfduet-1中的任意一种；所述的重组表达载体中导入了一个或两个拷贝的杂合贻贝蛋白的编码基因。优选地，步骤(1)的具体方法如下：fp-5蛋白基因由通用生物系统(安徽)有限公司合成，并连接至pet28a(+)载体，得到pet28a-fp-5质粒，接着，

17、(1)利用限制性内切酶sal i和xho i酶切，从pet28a-fp-5中分离出fp-5基因，并连接到xho i单酶切的pet28a-fp-3中，得到质粒pet28a-fp-35；

18、(2)利用限制性内切酶sal i和xho i酶切，从pet28a-fp-3中分离出fp-3基因，并连接到xho i单酶切的pet28a-fp-5中，得到质粒pet28a-fp-53；

19、(3)利用限制性内切酶sal i和xho i酶切，从pet28a-fp-35中分离出fp-35基因，并连接到xho i单酶切的pet28a-fp-5中，得到质粒pet28a-fp-535；

20、(4)利用限制性内切酶sal i和xho i酶切，从pet28a-fp-53中分离出fp-53基因，并连接到xho i单酶切的pet28a-fp-5中，得到质粒pet28a-fp-553；

21、(5)以pet28a-fp-535为模板，扩增出fp-535片段，连接到nco i和eco ri酶切的pacycduet-1载体中，得到第一质粒，随后分别用nde i和kpn i酶切第一质粒得到第一线性载体。以pet28a-fp-535为模板，扩增出fp-535片段，连接到上述第一线性载体中，获得含有两个fp-535片段的质粒pacycduet-2×fp535。

22、所得质粒均转化至表达宿主大肠杆菌e.coli bl21(de3)，得到重组菌。

23、其中，步骤(2)中，所述的接种，接种体积比为10％-20％；所述的发酵培养，发酵温度为32～37℃，发酵ph为6.5～7.5，总发酵时间为12～16h，溶氧为20～40％，通气量2～5l/min，在发酵至菌液的od600为30～50时加入0.1～1.2mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷iptg诱导发酵4～8h；当初始发酵培养基中的碳源耗尽，以30～60ml/h的流速加入补料培养基。优选地，所述的重组菌的种子液，将重组菌接种至种子培养基中逐级放大培养，获得种子液。

24、其中，所述的发酵培养基包括碳源、氮源和无机盐；优选地，所述的碳源为葡萄糖、甘油、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、木糖和水溶性淀粉中的任意一种或多种的组合；所述的氮源为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆干粉中的任意一种或多种的组合；所述的无机盐为硫酸镁和磷酸二氢钾中的任意一种或多种的组合；

25、优选地，所述的发酵培养基的配方为：10～30g/l甘油，20～40g/l酵母粉，10～30g/l蛋白胨，0.5～2g/l硫酸镁，2～8g/l磷酸二氢钾；

26、所述的补料培养基为50～500g/l的葡萄糖水溶液。

27、优选地，步骤(2)中，所述的提取，为柱层析或酸提取。优选为柱层析。

28、其中，柱层析的具体方法为，将发酵所得菌体用裂解缓冲液(0.1mol/l nah2po4，0.01mol/l tris-cl，8mol/l尿素，ph＝8.0)重悬，超声破碎后收取上清溶液，过膜后滤液与histrap hp层析柱结合，用洗涤缓冲液(0.1mol/l nah2po4，0.01mol/l tris-cl，8mol/l尿素，ph＝5.9)洗涤杂质，接着用洗脱缓冲液(0.5mol/l hcl)收集目的蛋白，最后用5％(v/v)的乙酸透析后冷冻干燥。

29、酸提取的具体方法为，将发酵所得菌体溶于pbs缓冲液，超声破碎后收取沉淀，先用25％(v/v)的乙酸过夜提取贻贝蛋白，最后用5％(v/v)的乙酸透析纯化后冷冻干燥。

30、进一步地，本发明还提供了贻贝蛋白粘附性能的对比方法，具体包括玻璃搭接实验和afm成像。

31、其中，所述玻璃搭接实验步骤为：将纯化的5mg贻贝蛋白溶于10μl 5％(v/v)乙酸中，均匀涂抹于玻璃基板的顶端后在37℃过夜粘合。搭接剪切实验使用万能试验机进行。

32、其中，afm成像实验步骤为：将纯化的贻贝蛋白以终浓度为1mg/ml溶于5％(v/v)乙酸中，取10μl滴于云母表面，在室温干燥后，用afm扫描蛋白质包被的云母片的高度图和相图。然后将云母片在纯水中冲洗4h后，用同样的方法观察云母表面残留的蛋白。使用nanoscope软件计算冲洗前后云母表面的颗粒覆盖率和粗糙度。优选的，黏附性能和涂覆力最强的杂合贻贝蛋白均为fp-535，黏附强度达到1.43mpa。

33、第五方面，本发明提供了第一方面所述的杂合贻贝蛋白在日用护肤、生物粘合和防水涂层方面的应用。

34、有益效果：

35、本发明提供了一种杂合贻贝蛋白及其构建和发酵制备方法，通过连接多个蛋白质片段增强了贻贝蛋白的表达量和粘性，并在摇瓶和发酵罐上进行了发酵工艺优化，实现了大肠杆菌的高密度发酵工艺高效合成高粘性贻贝蛋白。杂合蛋白fp-535具有优秀的涂覆力，黏附强度达到1.43mpa，在5l发酵罐上发酵12～14h的od600达到55～65，产量可达到1.5～2.0g/l。本发明建立的发酵工艺和纯化工艺，为工业化生产贻贝蛋白奠定了基础。