一种用于评测产品导致皮肤不适感的细胞芯片及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学，具体涉及一种用于评测产品导致皮肤不适感的体外细胞评测芯片及其应用。

背景技术：

1、哺乳动物的体感神经系统可以探测到各种各样的感觉，包括触觉、压力觉、冷/热觉、疼痛觉和瘙痒觉。因此，哺乳动物宿主可通过体感神经系统能够快速检测各种潜在的有害刺激并产生保护性行为反应。皮肤是体感神经系统的主要感觉输入来源之一，是对各种外部刺激(如机械、冷/热、化学、光等)的初步感应和响应。当皮肤受到外部刺激时，皮肤中的各种感受器会被激活，并通过神经纤维将刺激信号传递到大脑，这些信号在大脑中被解读和整合，使我们能够感知到各种外部刺激，并做出相应的反应和适应。依据这些感受器所响应的刺激类型和所传递的感觉信息不同，可以将这些感受器分为痛觉感受器、痒觉感受器、触觉感受器、冷/热感受器、压力觉感受器,嗅觉感受器，这些感受器在皮肤的不同区域有不同的分布密度和类型，使得人体能够对不同类型的刺激做出精细的感知和反应。

2、皮肤不适感是一个复杂的概念，涉及多种内外因素，但通常是指皮肤在受到物理、化学或精神等因素刺激时出现的一系列不愉快的感知，如感到紧绷感、刺痛感、烧灼感、痒感、热痛、痛感等。2020年，一项关于中国女性敏感肌肤人群敏感发作症状的调查显示78.9％的人群出现瘙痒，65.5％的人群出现刺痛感。

3、目前,关于皮肤不适感的评测主要是采用临床评价，临床评价的优点是最接近于真实效果，缺点如下：1)无法仪器评估，志愿者主观感知评价，差异比较大；2)需要的检测人员至少有三名，其中一位为临床医生；3)需要有效志愿者人数至少30例，志愿者难招募；4)临床评测安全风险大，志愿者参与后可能会损伤皮肤，需要一定的时间恢复；5)不能通量进行，一般一次只能测试一个样品，不适合筛选或化妆品原料测试；6)检测费用比昂贵，一般一个样品的费用可能在1万元人民币以上；7)临床评价误差很大，同一志愿者的不同部位相差较大，同一志愿者的相同部位在不同时间评价相差较大。

4、常规体外细胞评价方法优点如下：1)可高通量筛选；2)检测周期短，一般从确定进行到数据结果获得需要7个工作，熟练操作可能需要5个工作日；3)需要检测人员少：一般一个样品需要一个专业检测人员即可；4)检测费用低；一般10个样品的检测费用约1万元人民币；5)误差最小；6)检测结果稳定，同样的处理方式，不同的人员检测，结果稳定。但目前的体外细胞评价方法仍存在下述缺点：1)与临床评价结果相关度相对低；2)常规细胞中由于皮肤不适感相关感受器表达量低，不能模拟皮肤不适状态，不能用于皮肤的感知评测。3)皮肤的不适感知涉及多种皮肤感受器调控通路，单一的评价方式难以真实的评价其正常的生理功能。

5、随着细胞及分子生物学技术的发展、症状与机制的研究深入、细胞高内涵筛选和高通量复合筛选等的发展，可以在短时间内从大量化合物库中识别出潜在风险物质、活性物质及其靶点。细胞芯片技术是一种涉及多种交叉领域的高新技术，它通过在微型芯片上进行细胞的培养、处理和分析，实现对生物细胞的高通量筛选和功能研究。细胞芯片技术具有高通量、并行性及自动化的优点，这使得它在药物研究、超高通量筛选平台、药物基因组学、药物毒理学研究、药物分析耐药性研究、个性化药物及治疗研究等领域有着广泛的应用前景。当前关于细胞芯片在皮肤相关基础研究的已有报道，然而，利用细胞芯片评测产品导致皮肤不适感的研究目前还没有相关报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种用于评测产品导致皮肤不适感的细胞芯片及其应用。利用该细胞芯片评测产品导致皮肤不适感的方法，使得所述细胞芯片能够方便快捷、准确灵敏的评测产品导致的皮肤不适感。

2、本发明的另一个目的在于提供上述细胞芯片在评测化妆品、洗护品、保健品导致皮肤不适感中的应用。

3、皮肤感知是指皮肤通过其神经和细胞组成的复杂系统对各种外部刺激做出响应的过程。这个过程涉及到两个主要的途径：

4、(i)皮肤的初始感知：当外界刺激物直接作用于皮肤的角质形成细胞时，角质形成细胞会释放多种生物活性分子，如细胞因子、前列腺素和化学趋化因子等，来响应这些刺激。这个过程被称为皮肤的初始感知。这种响应是非神经性的，主要涉及到皮肤屏障的功能和免疫反应的激活。

5、(ii)皮肤的神经感知：外界刺激物也可以直接作用于皮肤中的神经纤维，神经纤维会响应这些刺激，并通过神经信号传递给大脑进行解码，产生相应的感知，如痛觉、温觉、触觉等。这个过程被称为皮肤的神经感知。皮肤的神经纤维可以分为多种类型，每种类型都有特定的感受范围和响应特性，从而使得我们能够感受到丰富多样的感觉信息。

6、正常的皮肤感知功能有利于生物体适应环境、免受伤害，高灵敏的异常皮肤感觉为生物体带来不愉快的感觉(皮肤不适感)，降低生活质量。本发明中评测产品评测通过皮肤的初始感知导致皮肤不适感的细胞芯片技术中的宿主细胞选择过表达感觉受体基因的hacat细胞(人永生化角质形成细胞)。本发明中评测产品评测通过皮肤的神经感知导致皮肤不适感的细胞芯片技术中的宿主细胞选择过表达感觉受体基因的sh-sy5y细胞(人神经母细胞瘤细胞系)。

7、皮肤不适感的发生是不同感受器相互作用的结果，本发明中的皮肤不适感以痛觉、痒觉、热觉为主，嗅觉、压力觉、冷觉、触觉为辅，检测产品导致皮肤不适感的细胞芯片技术的感觉受体设计以此为依据。

8、根据结构分类，上述热/痛/痒觉受体以离子通道受体、g蛋白偶联受体为主，其它类型受体为辅。本发明中检测产品导致皮肤不适感的感觉受体基因选择离子通道受体和g蛋白偶联受体。

9、皮肤不适感的发生是对各种外部刺激激活的复杂调控反应的结果，是一种复杂的、混合不愉快感觉，涉及痛觉、痒觉、热/冷觉、嗅觉、压力觉、触觉受体的激活及相互作用。

10、参与皮肤痛觉调控的感觉受体基因主要来源于trps(transient receptorpotential,trps)受体家族、内皮素受体(endothelin receptors)家族、大麻素受体(cannabinoid receptor)家族、甘丙肽受体(galanin receptors)家族、gaba受体、神经激肽受体(neurokinin receptors，nkrs)家族、阿片受体(opioid receptors)、酸敏感离子通道受体(acid-sensing ion channels,asics)家族、肾上腺素能受体(adrenergicreceptors,ars)、mrgpr受体(mas-related g-protein-coupled receptors)家族、cgrp受体(calcitonin gene-related peptide receptors)家族、血清素受体家族(5-htreceptors，htrs)、前列腺素受体(prostaglandin receptors,ptgs)、细胞因子受体、toll样受体(tlrs)。

11、参与皮肤痒觉调控的感觉受体基因主要来源于trps(transient receptorpotential,trps)受体家族、神经激肽受体(neurokinin receptors，nkrs)、血小板激活因子受体(platelet-activating factor receptors paf-rs)、溶血磷脂酸受体(lysophosphatidic acid receptors,lpa受体)家族、蛋白酶激活受体家族(protease-activated receptors,pars)、组胺受体(histamine receptors,hrs)家族、血清素受体家族(htrs)、mrgpr受体(mas-related g-protein-coupled receptors)家族、tslp受体(tcell activating and proliferation-inducing molecule receptor,tslpr)、细胞因子受体(cytokine receptors)、toll样受体(tlrs)、白三烯受体(leukotriene receptors,lts)。

12、参与皮肤触觉调控的感觉受体基因主要来源于piezo家族、黏附型g-蛋白偶联受体(adhesion g-protein-coupled receptors,agpcrs)。

13、参与皮肤冷/热调控的感觉受体基因主要来源于trps(transient receptorpotential,trps)受体家族、血清素受体家族(htrs)。

14、参与皮肤压力觉调控的感觉受体基因主要来源于血清素受体家族(htrs)、神经激肽受体(neurokinin receptors，nkrs)、肾上腺素能受体(adrenergic receptors,ars)、内皮素受体(endothelin receptors)家族、血清素受体家族(htrs)、甘丙肽受体(galaninreceptors)家族。

15、参与嗅觉调控的感觉受体基因主要来源于嗅觉受体(olfactory receptors,or)。

16、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

17、第一方面，本发明提供了一种感觉受体基因的过表达细胞在制备用于评测产品导致皮肤不适感的产品中的应用，所述感觉受体基因的过表达细胞包括trps受体家族的过表达细胞、组胺受体家族的过表达细胞、蛋白酶激活受体家族的过表达细胞和前列腺素受体家族的过表达细胞。

18、作为优选方案，所述trps受体家族包括trpv1、trpv2、trpv3、trpv4、trpc1、trpc4、trpm8、trpa1中的至少一种；

19、所述组胺受体家族包括hrh1、hrh2、hrh4中的至少一种；

20、所述蛋白酶激活受体包括par-2、par-4中的至少一种；

21、所述前列腺素受体家族包括ep1、ep4中的至少一种。

22、作为进一步的优选方案，所述trps受体家族包括trpv1、trpv3、trpv4；所述组胺受体家族包括hrh1；所述蛋白酶激活受体包括par-2；所述前列腺受体家族包括ep1。

23、作为进一步的优选方案，所述感觉受体基因的过表达细胞包括trpv1的过表达细胞、trpv3的过表达细胞、trpv4的过表达细胞、hrh1的过表达细胞、par-2的过表达细胞和ep1的过表达细胞。

24、作为优选方案，所述感觉受体基因的过表达细胞还包括内皮素受体家族的过表达细胞、酸敏感离子通道受体家族的过表达细胞、肾上腺素能受体家族的过表达细胞、mrgpr受体家族的过表达细胞中的至少一种；

25、所述内皮素受体家族包括ednra、ednrb中的至少一种；

26、所述酸敏感离子通道受体家族包括asic3；

27、所述肾上腺素能受体家族包括adra1a、adra1b、adra1d中的至少一种；

28、所述mrgpr受体家族包括mrgprx1、mrgprx4、mrgprf、mrgprf、mrgpra3中的至少一种。

29、作为进一步的优选方案，所述内皮素受体家族包括ednra；所述酸敏感离子通道受体家族包括asic3；所述肾上腺素能受体家族包括adra1a；所述mrgpr受体家族包括mrgprx1。

30、作为进一步的优选方案，所述感觉受体基因的过表达细胞包括trpv1的过表达细胞、trpv3的过表达细胞、trpv4的过表达细胞、hrh1的过表达细胞、par-2的过表达细胞和ep1的过表达细胞，还包括ednra的过表达细胞、asic3的过表达细胞、adra1a的过表达细胞、mrgprx1的过表达细胞中的至少一种。最优选感觉受体基因的过表达细胞包括trpv1的过表达细胞、trpv3的过表达细胞、trpv4的过表达细胞、hrh1的过表达细胞、par-2的过表达细胞和ep1的过表达细胞、ednra的过表达细胞、asic3的过表达细胞、adra1a的过表达细胞、mrgprx1的过表达细胞。

31、作为优选方案，所述感觉受体基因的过表达细胞为过表达感觉受体基因的hacat细胞或sh-sy5y细胞。

32、作为优选方案，所述感觉受体基因的过表达细胞包括trpv1的过表达hacat细胞、trpv3的过表达hacat细胞、trpv4的过表达hacat细胞、hrh1的过表达hacat细胞、par-2的过表达hacat细胞和ep1的过表达hacat细胞，或trpv1的过表达sh-sy5y细胞、trpv3的过表达sh-sy5y细胞、trpv4的过表达sh-sy5y细胞、hrh1的过表达sh-sy5y细胞、par-2的过表达sh-sy5y细胞和ep1的过表达sh-sy5y细胞；还包括ednra的过表达hacat细胞、asic3的过表达hacat细胞、adra1a的过表达hacat细胞、mrgprx1的过表达hacat细胞中的至少一种，或ednra的过表达sh-sy5y细胞、asic3的过表达sh-sy5y细胞、adra1a的过表达sh-sy5y细胞、mrgprx1的过表达sh-sy5y细胞中的至少一种。

33、第二方面，本发明提供了一种用于评测产品导致皮肤不适感的细胞芯片，所述细胞芯片包括含有感觉受体基因的过表达细胞的检测孔；

34、所述感觉受体基因包括trps受体家族的过表达细胞、组胺受体家族的过表达细胞、蛋白酶激活受体家族的过表达细胞和前列腺素受体家族的过表达细胞；

35、所述trps受体家族包括trpv1、trpv2、trpv3、trpv4、trpc1、trpc4、trpm8、trpa1中的至少一种；

36、所述组胺受体家族包括hrh1、hrh2、hrh4中的至少一种；

37、所述蛋白酶激活受体包括par-2、par-4中的至少一种；

38、所述前列腺素受体家族包括ep1、ep4中的至少一种。

39、作为优选方案，所述感觉受体基因的过表达细胞还包括内皮素受体家族的过表达细胞、酸敏感离子通道受体家族的过表达细胞、肾上腺素能受体家族的过表达细胞、mrgpr受体家族的过表达细胞中的至少一种；

40、所述内皮素受体家族包括ednra、ednrb中的至少一种；

41、所述酸敏感离子通道受体家族包括asic3；

42、所述肾上腺素能受体家族包括adra1a、adra1b、adra1d中的至少一种；

43、所述mrgpr受体家族包括mrgprx1、mrgprx4、mrgprf、mrgprf、mrgpra3中的至少一种。

44、作为优选方案，所述感觉受体基因的过表达细胞为过表达感觉受体基因的hacat细胞或sh-sy5y细胞。

45、作为优选方案，含有各感觉受体基因的过表达细胞的检测孔为3-5个。

46、第三方面，本发明还提供了一种用于评测产品导致皮肤不适感的非疾病诊断目的的方法，包括以下步骤：

47、s1、细胞培养：将细胞芯片中含有各感觉受体基因的过表达细胞的检测孔中加入培养基进行培养；

48、s2、染色：弃培养基，采用缓冲液清洗后，加入含有钙离子荧光探针的染色液对各感觉受体基因的过表达细胞进行染色；

49、s3、染色结束后，使用缓冲液清洗，再加入缓冲液，准备好待测样品，仪器自动加入待测样品，并进行实时检测；

50、s4、对采集的数据进行处理，计算得到各检测孔的钙离子信号荧光强度的变化倍数，然后将钙离子信号荧光强度的变化倍数转换为皮肤不适感评分，再计算得到皮肤不适感的综合评分，最后由皮肤不适感的综合评分确定待测产品导致皮肤不适感的等级。

51、作为优选方案，步骤s4中，所述钙离子信号荧光强度的变化倍数的计算公式如下公式(1)所示：

52、rfufold change＝(rfu待测产品组-rfu阴性对照组)/rfu阴性对照组   (1)

53、其中，rfufold change为钙离子信号荧光强度的变化倍数；rfu待测产品组为待测产品的钙离子信号荧光强度值，rfu阴性对照组为加入1×hhbs缓冲液的钙离子信号荧光强度值。

54、作为优选方案，步骤s4中，所述皮肤不适感评分的转换标准如下：

55、rfufold change<3时，ds＝0；

56、3≦rfufold change≦10时，ds＝1；

57、10<rfufold change≦20时，ds＝2；

58、20<rfufold change≦30时，ds＝3；

59、30<rfufold change≦40时，ds＝4；

60、rfufold change>40时，ds＝5；

61、其中，ds为皮肤不适感评分。

62、作为优选方案，步骤s4中，所述皮肤不适感的综合评分的计算公式如下公式(2)所示：

63、ts＝∑i(dsi)   (2)

64、其中，ts为皮肤不适感的综合评分；i为检测的感觉受体基因的数量；dsi为各复孔感觉受体基因的皮肤不适感评分的平均值；

65、步骤s4中，所述皮肤不适感的等级划分标准如下：

66、0≦ts≦1时，皮肤不适感等级为：无皮肤不适感；

67、1<ts≦2时，皮肤不适感等级为：轻度皮肤不适感；

68、ts>2时，皮肤不适感等级为：中度/重度皮肤不适感。

69、作为优选方案，步骤s1中，各检测孔中，含有各感觉受体基因的过表达细胞为对数生长期的细胞，接种密度为3.5w/孔～0.6w/孔；所述芯片的检测孔孔数可以是384个或者96个；所述培养时间为18～20h。

70、作为优选方案，步骤s2中，所述加入含有钙离子荧光探针的染色液的体积为30～100μl；如芯片的孔数为96孔时，加入100μl；孔数为384孔时，加入30μl。所述钙离子荧光探针为cal 520-am。

71、作为优选方案，步骤s2和s3中，所述缓冲液为1×hhbs缓冲液；所述染色时间为55～65min。

72、作为优选方案，步骤s3中，所述待测样品，需满足以下条件：

73、a)均匀的溶解于水溶液中；

74、b)不改变细胞形态，无细胞毒性；

75、c)无自发光，不与所选择钙离子荧光探针发生结合。

76、作为优选方案，所述待测样品可直接通过皮肤初始感知途径引发皮肤不适感时，采用过表达感觉受体基因的hacat细胞,例如组胺、辣椒素、乳酸等；所述待测样品可直接通过皮肤神经感知途径引发皮肤不适感时，采用过表达感觉受体基因的sh-sy5y细胞，例如肾上腺素、组胺、乳酸等。

77、作为优选方案，步骤s3中，所述待测样品与1×hhbs缓冲液配制成2×工作液后加入。

78、作为优选方案，步骤s3中，所述缓冲液加入的体积为20～50μl；如芯片的孔数为96孔时，加入50μl；孔数为384孔时，加入20μl。

79、作为优选方案，步骤s3中，所述仪器为钙流检测仪器，如flexstation 3(molecular devices)或flipr tetra系统(molecular devices)。所述待测样品的加入体积与缓冲液体积相同。

80、不同的受体激活后的信号通路不同、引发生理功能不同，本发明中检测产品导致皮肤不适感的细胞芯片的结果通过靶点激活后的钙离子(ca 2+)信号变化倍数进行评分，再将各感觉受体基因评分进行求和获得最终的得分，可以获得不同浓度的评测样品导致皮肤不适感的评分结果。

81、采用本发明检测产品导致皮肤不适感的细胞芯片对不同浓度的辣椒素、组胺、十二烷基硫酸钠(sls)、dl-乳酸进行检测，结果发现细胞检测浓度的10000倍与临床皮肤不适感评分结果保持一致。而芯片中通过对单一感觉受体进行单独计算评分时，部分评价结果存在极大的误差；所选择感觉受体越多，细胞评价结果和临床评价结果越相关。应用于具体产品的检测时，产品可直接通过皮肤初始感知途径诱发皮肤不适感时细胞芯片技术中的细胞优选择过表达感觉受体基因的hacat细胞。应用于具体产品的检测时，产品可直接通过皮肤神经感知途径诱发皮肤不适感时细胞芯片技术中的细胞优选择过表达感觉受体基因的sh-sy5y细胞。

82、由以上技术方案可知，本发明检测产品导致皮肤不适感的细胞芯片包含皮肤不适感的关键感受器受体，通过特定评分计算结果，能够为产品在改善皮肤不适感，原料筛选和个体化皮肤产品检测方面提供参考依据。

83、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

84、1.与现在单一的感知的评测相比，本发明将皮肤不适感进行整体归纳总结，并找到参与皮肤不适感调控的关键感觉受体，从中选择trps受体家族、组胺受体家族、蛋白酶激活受体家族、前列腺素受体家族、内皮素受体家族、酸敏感离子通道受体家族、肾上腺素能受体家族和mrgpr受体家族中的多个感觉受体基因作为综合评价指标，以此获得了一种更精准的用于评测产品导致皮肤不适感的方法和产品。

85、2.本发明采用过表达的方式构建的稳定细胞株可模拟皮肤异常灵敏感知下表达量高的皮肤感觉受体，将这些细胞制成细胞芯片的形式，采用体外细胞内钙离子荧光信号强度的变化倍数通过特定评分计算关联到临床皮肤不适感的评测，从而可将体外细胞芯片的评测作为临床皮肤不适感评测的预测模型。由此为化妆品、护肤品、皮肤外用涂抹品等产品进行皮肤不适感的评测，为皮肤不适感的评测提供了一种创新的、精准的、可替代临床的体外细胞学方法。

86、3.采用本发明提供的细胞芯片技术方案与临床评价结果的关联性强、假阳性结果少，且相比临床评价的方法具有测试成本较低、可重复性高、测试周期短、筛选通量高的优点。