药物组合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种药物组合物及其应用。

背景技术：

1、肿瘤是机体组织细胞增生所形成的非正常的新生物，目前全球的肿瘤发病率和死亡率较高，除了传统的手术治疗和放化疗外，探索新的有效的治疗方式刻不容缓。mrna治疗性药物是将mrna制备成疫苗或者药物，注射到体内，将“机体细胞”变成“疫苗/药物加工厂”，具有安全性高、生产速度快、疫苗保护效率高等特点，可用于肿瘤治疗。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种药物组合物及其应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括核酸组合物和/或聚核苷酸，以及递送载体；

3、所述核酸组合物包含编码肿瘤相关抗原的核酸分子和/或编码免疫调节分子的核酸分子；

4、所述聚核苷酸编码的融合产物包含肿瘤相关抗原和/或免疫调节分子；

5、其中，所述免疫调节分子包括①～④中的至少一种：

6、①免疫共刺激分子；

7、②细胞因子；

8、③趋化因子及趋化因子受体；

9、④其他免疫调节分子。

10、优选地，所述核酸组合物包括如下任一组合：

11、1)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子；

12、2)至少一种编码免疫调节分子的核酸分子；

13、3)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子和至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子；

14、4)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子和至少一种编码细胞因子的核酸分子；

15、5)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子和至少一种编码趋化因子及趋化因子受体的核酸分子；

16、6)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子和至少一种编码其他免疫调节分子的核酸分子；

17、7)至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子和至少一种编码细胞因子的核酸分子；

18、8)至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子和至少一种编码趋化因子及趋化因子受体的核酸分子；

19、9)至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子和至少一种编码其他免疫调节分子的核酸分子；

20、10)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子以及至少一种编码细胞因子的核酸分子；

21、11)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子以及至少一种编码趋化因子及趋化因子受体的核酸分子；

22、12)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子以及其他免疫调节分子的核酸分子；

23、13)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码细胞因子的核酸分子以及至少一种编码趋化因子及趋化因子受体的核酸分子；

24、14)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码细胞因子的核酸分子以及其他免疫调节分子的核酸分子；

25、15)至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子、至少一种编码细胞因子的核酸分子以及趋化因子及趋化因子受体的核酸分子；

26、16)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码趋化因子及趋化因子受体的核酸分子以及至少一种编码其他免疫调节分子的核酸分子；

27、17)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子、至少一种编码细胞因子的核酸分子以及至少一种编码趋化因子及趋化因子受体的核酸分子；

28、18)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码细胞因子的核酸分子、至少一种编码趋化因子及趋化因子受体的核酸分子以及至少一种编码其他免疫调节分子的核酸分子；

29、19)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子、至少一种编码趋化因子及趋化因子受体的核酸分子以及至少一种编码其他免疫调节分子的核酸分子；

30、20)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子、至少一种编码细胞因子的核酸分子、以及至少一种编码其他免疫调节分子的核酸分子；

31、21)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子、至少一种编码细胞因子的核酸分子、以及至少一种编码趋化因子及趋化因子受体的核酸分子；

32、22)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子、至少一种编码免疫共刺激分子的核酸分子、至少一种编码细胞因子的核酸分子、至少一种编码趋化因子及趋化因子受体的核酸分子以及至少一种编码其他免疫调节分子的核酸分子。

33、其中，所述核酸组合物中各核酸分子按等质量比混合。

34、所述核酸分子包括rna，优选地，所述核酸分子包括mrna。

35、优选地，所述聚核苷酸包括如下任一组合：

36、1)编码至少两种肿瘤相关抗原的融合产物的核酸分子；

37、2)编码至少两种免疫调节分子的融合产物的核酸分子；

38、3)编码至少一种肿瘤相关抗原和至少一种免疫共刺激分子的融合多肽的核酸分子；

39、4)编码至少一种肿瘤相关抗原和至少一种细胞因子的融合产物的核酸分子；

40、5)编码至少一种肿瘤相关抗原和至少一种趋化因子及趋化因子受体的融合产物的核酸分子；

41、6)编码至少一种肿瘤相关抗原和至少一种其他免疫调节分子的融合产物的核酸分子；

42、7)编码至少一种免疫共刺激分子和至少一种细胞因子的融合产物的核酸分子；

43、8)编码至少一种免疫共刺激分子和至少一种趋化因子及趋化因子受体的融合产物的核酸分子；

44、9)编码至少一种免疫共刺激分子和至少一种其他免疫调节分子的融合产物的核酸分子；

45、10)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种免疫共刺激分子以及至少一种细胞因子的融合产物的核酸分子；

46、11)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种免疫共刺激分子以及至少一种趋化因子及趋化因子受体的融合产物的核酸分子；

47、12)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种免疫共刺激分子以及其他免疫调节分子的融合产物的核酸分子；

48、13)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种细胞因子以及至少一种趋化因子及趋化因子受体的融合产物的核酸分子；

49、14)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种细胞因子以及其他免疫调节分子的融合产物的核酸分子；

50、15)编码至少一种免疫共刺激分子、至少一种细胞因子以及趋化因子及趋化因子受体的融合产物的核酸分子；

51、16)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种趋化因子及趋化因子受体以及至少一种其他免疫调节分子的融合产物的核酸分子；

52、17)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种免疫共刺激分子、至少一种细胞因子以及至少一种趋化因子及趋化因子受体的融合产物的核酸分子；

53、18)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种细胞因子、至少一种趋化因子及趋化因子受体以及至少一种其他免疫调节分子的融合产物的核酸分子；

54、19)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种免疫共刺激分子、至少一种趋化因子及趋化因子受体以及至少一种其他免疫调节分子的融合产物的核酸分子；

55、20)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种免疫共刺激分子、至少一种细胞因子、以及至少一种其他免疫调节分子的融合产物的核酸分子；

56、21)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种免疫共刺激分子、至少一种细胞因子、以及至少一种趋化因子及趋化因子受体的融合产物的核酸分子；

57、22)编码至少一种肿瘤相关抗原、至少一种免疫共刺激分子、至少一种细胞因子、至少一种趋化因子及趋化因子受体以及至少一种其他免疫调节分子的融合产物的核酸分子；

58、其中，所述融合产物的各单体之间通过linker连接。

59、进一步地，所述核酸组合物和聚核苷酸包括如下任一组合：

60、(1)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子和至少一种编码免疫共刺激分子和细胞因子的聚核苷酸；

61、(2)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子和至少一种编码细胞因子和趋化因子及趋化因子受体的聚核苷酸；

62、(3)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子和至少一种编码趋化因子及趋化因子受体和其他免疫调节分子的聚核苷酸；

63、(4)至少一种编码肿瘤相关抗原的核酸分子和至少一种编码免疫共刺激分子、细胞因子和趋化因子及趋化因子受体的聚核苷酸。

64、优选地，所述肿瘤相关抗原包括如下至少一种分子：psma、pap、psca、tgm4、msln、cldn18.2、cldn6、mage-a3、5t4、steap1、steap2、trop2、nectin4、vimentin、muc1、frα、mage-a4、egfrviii、ca9；

65、所述免疫共刺激分子包括如下至少一种分子：b7-1、b7-2、b7-h2、b7-h3、cd40、fasl、cd70、cd30l、4-1bbl、ox40l、trail、rankl、tweak、april、baff、light、gitrl等。

66、所述细胞因子包括如下至少一种分子：il-12a、il-12b、il-15、il-18、il-33、il-23、il-27、flt-3l等。

67、所述趋化因子及趋化因子受体包括如下至少一种分子：ccl20、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、ccr7、cxcr4、ccr5、ccl4、ccl5、ccl19、cxcr3、ccr6等。

68、所述其他免疫调节分子包括如下至少一种分子：cd73、stat1、irf4、ccar2、bcl6、inos、cd103等。

69、进一步地，本发明的药物组合物：

70、(1)编码b7-1、b7-2、b7-h2、b7-h3、cd40、fasl、cd70、cd30l、4-1bbl、ox40l、trail、il-33、il-23、il-27、flt-3l、cxcl9、cxcl10、ccr7、cd73、cd103、psma、pap、psca、tgm4、msln、cldn18.2、5t4、cldn6、muc1、steap1、steap2、egfrviii的核酸分子序列分别如seq idno:1-32所示；

71、(2)组合物1(hs2304-pl12):cxcl9-p2a-cxcl10、免疫分子组合物2immuner1(hs2301-pl06)：4-1bbl-p2a-flt-3l-ires(emcv)-ccr7、免疫分子组合物3immuner2(hs2301-pl08)：ccr7-p2a-4-1bbl-ires(emcv)-flt-3l-p2a-ox40l、肿瘤相关抗原组合物4(hs2303-pl47)：psca-psma-ires(emcv)-tgm4-pap、肿瘤相关抗原组合物5(hs2303-pl48)：psca-tgm4-psma、组合物6(hs2301-pl11)：cldn18.2-cd70的核酸分子序列分别如seq idno:33-38所示；

72、优选地，b7-1、b7-2、b7-h2、b7-h3、cd40、fasl、cd70、cd30l、4-1bbl、ox40l、trail、il-33、il-23、il-27、flt-3l、cxcl9、cxcl10、ccr7、cd73、cd103、psma、pap、psca、tgm4、msln、cldn18.2、5t4、cldn6、muc1、steap1、steap2、egfrviii的氨基酸序列分别如seq idno:39-70所示，编码组合物1(hs2304-pl12):cxcl9-p2a-cxcl10、免疫分子组合物2immuner1(hs2301-pl06)：4-1bbl-p2a-flt-3l-ires(emcv)-ccr7、免疫分子组合物3immuner2(hs2301-pl08)：ccr7-p2a-4-1bbl-ires(emcv)-flt-3l-p2a-ox40l、肿瘤相关抗原组合物4(hs2303-pl47)：psca-psma-ires(emcv)-tgm4-pap、肿瘤相关抗原组合物5(hs2303-pl48)：psca-tgm4-psma、组合物6(hs2301-pl11)：cldn18.2-cd70的氨基酸序列分别如seq id no:71-76所示。

73、进一步地，所述核酸组合物及聚核苷酸中的核酸分子包含编码信号肽的核酸序列。

74、优选地，所述编码信号肽的核酸序列是密码子优化的。

75、进一步地，所述核酸组合物及聚核苷酸中的核酸分子包含5′非翻译区和/或3′非翻译区。

76、更进一步地，所述核酸组合物及聚核苷酸中的核酸分子包括5′非翻译区的修饰，所述修饰包括5′帽子结构。

77、更进一步地，所述核酸组合物及聚核苷酸中的核酸分子包括3′非翻译区的修饰，所述修饰包括polya尾巴。

78、进一步地，所述核酸组合物及聚核苷酸中的核酸分子包括一个或多个连续核苷酸的接头序列。

79、进一步地，所述核酸组合物及聚核苷酸中的核酸分子包括一个或多个亚基因组启动子。

80、进一步地，所述mrna为闭合环状分子或线性分子。

81、第二方面，本发明提供一种聚核苷酸，其编码的产物包含所述肿瘤相关抗原和免疫调节分子。

82、优选地，各分子之间通过linker连接。

83、第三方面，本发明提供含有所述聚核苷酸的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

84、第四方面，本发明提供含有所述聚核苷酸的重组表达载体，骨架载体可以是paav-mcs、pcdna3.1(+)、pcmv-mcs、pegfp-ctsb或plvx-pax1等。

85、进一步地，所述重组表达载体的启动子可以是lac乳糖操纵子、tac启动子、trc启动子或t7启动子等。

86、第五方面，本发明提供一种转化体，所述转化体是在宿主细胞中导入所述聚核苷酸或所述重组表达载体构建得到的。

87、进一步地，所述宿主细胞为原核细胞和/或真核细胞。优选分离的哺乳动物细胞。更优选所述哺乳动物细胞来自于人类。

88、进一步地，本发明的递送载体包括脂质体纳米颗粒。

89、优选地，所述脂质体纳米颗粒包括阳离子脂质；其中，所述阳离子脂质占所述药物组合物的摩尔百分比为30％～60％，优选45％～55％。

90、优选地，所述递送载体还包括结构脂质、辅助脂质和/或聚合物结合的脂质。

91、优选地，所述聚合物结合的脂质包括一种或多种peg修饰的脂质；更优选地，所述peg修饰选自dag-peg、daa-peg、dmg-peg、cer-peg和dspe-peg等中的一种或多种；其中，所述peg修饰的脂质占所述药物组合物的摩尔百分比为1％～10％；更优选地，所述peg的相对分子质量为2000～5000，最优选2000、3000、4000或5000。

92、优选地，所述辅助脂质选自dspc、dopc、dppg、dops和dope等中的一种或多种，更优选dspc和/或dops，最优选dspc；所述辅助脂质占所述药物组合物的摩尔百分比为2％～20％。

93、所述结构脂质选自胆固醇、胆固醇酯、固醇类激素、固醇类维生素和植物甾醇等中的一种或多种，更优选胆固醇、胆固醇酯和植物甾醇等中的一种或多种，最优选胆固醇；其中，所述结构脂质占所述药物组合物的摩尔百分比为15％～60％。

94、进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载剂或赋形剂。

95、进一步地，所述药物组合物可以是口服制剂、冻干制剂或注射制剂。

96、进一步地，将所述被脂质纳米颗粒包裹的mrna进行肌肉注射。

97、进一步地，将所述被脂质纳米颗粒包裹的mrna进行静脉注射。

98、进一步地，将所述被脂质纳米颗粒包裹的mrna进行皮下注射。

99、第六方面，本发明提供一种在哺乳动物细胞中表达多肽的方法，所述方法包括使哺乳动物细胞与所述的药物组合物接触。

100、第七方面，本发明提供一种抗体筛选的方法，所述方法包括向个体施加所述的药物组合物。

101、第八方面，本发明提供一种诱导个体中和抗原特异性免疫应答的方法，所述的方法包括向个体施加所述核酸组合物或所述药物组合物。

102、第九方面，本发明提供所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

103、所述肿瘤包括实体瘤。

104、优选地，所述实体瘤包括前列腺瘤、宫颈瘤、结直肠癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、脑胶质瘤、肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌等。

105、第十方面，本发明提供一种治疗肿瘤的方法，所述的方法包括向肿瘤患者施加所述核酸组合物或所述药物组合物。

106、第十一方面，本发明提供所述组合物在制备预防或治疗肿瘤的疫苗中的应用。

107、在本发明的一个具体实施方式中，编码免疫调节分子的mrna组合物被脂质纳米颗粒包裹，其制备方法包括：

108、将可离子化脂质、dspc(二硬酯酰磷脂酰胆碱)、胆固醇和dmg-peg2000按照固定的配方摩尔比47.5:10:41:1.5溶解在无水乙醇中，即乙醇相；将mrna组合物溶解在醋酸钠溶液(25mm，ph5.0)中，即水相；将乙醇相和水相分别用无菌注射器插入微流控芯片两端，利用微流控设备将乙醇相与水相混合，控制乙醇相与水相的体积比为1:3，脂质纳米颗粒溶液。利用超滤技术，用pbs+20mm tris-hcl溶液进行超滤，除去乙醇和一些小分子杂质。然后对所制备的包裹了脂质纳米颗粒的mrna(mrna-lnp)进行质量控制，主要包括包封率、粒径及zeta电位等参数。其中包封率大于90％，粒径为70-100nm左右，zeta为±10之间。

109、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

110、本发明将编码不同肿瘤相关抗原和/或免疫调节分子核酸组合物或聚核苷酸的药物组合物用于预防或治疗肿瘤，其疗效比单药(仅单条mrna抗原)的疗效更佳。