用于诱导持续免疫反应的含有磷酸化Tau肽的脂质体的制作方法

本发明属于医学领域。本发明特别涉及含有磷酸化tau肽的脂质体，其用于在需要预防或治疗tau蛋白病(诸如阿尔茨海默病)的受试者中诱导针对磷酸化tau蛋白(ptau)的持续抗体反应。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(ad)是一种进行性衰弱性神经退行性疾病，在世界范围内估计影响4400万人(alzheimers.net)。目前商业化的ad疗法旨在作用于临床症状，而不靶向导致疾病的致病过程(疾病修饰作用)。不幸的是，目前的疗法仅最低限度有效，并因此迫切需要开发和测试另外的预防性和治疗性措施。

2、阿尔茨海默病的标志性病理是细胞外斑块的积聚，所述细胞外斑块包含显著聚集的淀粉样β蛋白和过度磷酸化的tau蛋白的细胞内“缠结”或聚集体。导致这些蛋白的积聚的分子事件的表征不佳。对于淀粉样蛋白，有假说认为淀粉样蛋白前体蛋白的异常切割导致包含氨基酸1-42的易聚集片段的积聚。对于tau，有假说认为激酶、磷酸酶或两者的失调导致tau的异常磷酸化。一旦tau变得过度磷酸化，其就会失去有效结合和稳定微管的能力，而改为积聚在受影响的神经元的细胞质中。未结合和过度磷酸化的tau似乎会形成第一寡聚物，并随后形成更高阶的聚集体，其存在可能会对它们形成于其中的神经元的功能产生负面影响，可能经由正常轴突运输的中断。

3、在发达国家，被诊断患有阿尔茨海默病或其他痴呆性tau蛋白病的个体通常用胆碱酯酶抑制剂(例如)或美金刚(例如namendatm)来治疗。这些药物虽然耐受性相当不错，但功效非常一般。例如，在大约50％的经治疗的个体中，将症状的恶化延迟6-12个月。其余的治疗是非药理性的，并且聚焦于随着患者认知能力下降，使其更有能力处理日常事务。

4、近来已经公开了adamant(其为aadvac1的一项24个月的双盲、平行组、随机化2期多中心安慰剂对照试验，aadvac1是设计为靶向阿尔茨海默病中的病理性tau的活性肽疫苗(eudract 2015-000630-30))的结果(novak等人,nature aging第1卷:521–534,2021)。aadvac1含有通过n末端半胱氨酸与钥孔戚血蓝素(klh)连接的衍生自tau序列的氨基酸294至305的合成肽。在试验过程中，以每剂40μg向患有轻度ad痴呆的患者施用11剂aadvac1。尽管该疫苗诱导高水平的igg抗体，但在认知和功能测试中未发现对整个研究样本的显著影响(同上)。

5、aci-35为使用基于人p-tau396/404的合成肽的疫苗，其显示改善携带p301l突变的小鼠的运动能力并延长其存活(theunis等人,plos one.2013.8(8):e72301)。在1b期研究中，aci-35耐受良好并引发抗体反应，但可加强性(boostability)有限。

6、需要用于神经元退行性疾病，诸如阿尔茨海默病的安全和有效的治疗。

技术实现思路

1、本发明基于来自改善的脂质体疫苗的临床研究的发现，所述脂质体疫苗包含呈递在脂质体表面上的磷酸化tau肽。该疫苗诱导有效和持续的免疫反应，诸如针对ptau的持续抗体反应，并且抗体反应可通过加强注射(booster shots)来加强。

2、因此，在一个一般方面，本发明提供在有需要的人受试者中诱导针对磷酸化tau蛋白(ptau)的抗体反应的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的脂质体，所述脂质体含有：(1)由选自seq id no:27至seq id no:29和seq id no:31至seq id no:38的氨基酸序列组成的tau磷酸肽，其量为每剂25-750纳摩尔，诸如300μg至1800μg；

3、(2)包含单磷酰基脂质a的toll样受体4激动剂；

4、(3)具有选自seq id no:13至seq id no:17、seq id no:23至seq id no:26、和seq id no:39至seq id no:44的氨基酸序列的辅助性t细胞表位；和

5、(4)具有选自seq id no:18至seq id no:22的核苷酸序列的cpg寡核苷酸，

6、其中：

7、tau磷酸肽呈递在脂质体的表面上，且

8、在向人受试者初始施用有效量的脂质体后，抗体反应持续至少6周，诸如至少6、7、8、9、10周。

9、在一些实施方案中，有效量的脂质体包含：

10、(1)由seq id no:28的氨基酸序列组成的tau磷酸肽，其量为每剂300μg至1800μg；

11、(2)toll样受体4激动剂，其量为每剂100μg至585μg；

12、(3)辅助性t细胞表位，其量为每剂75μg至550μg；和

13、(4)cpg寡核苷酸，其量为每剂100μg至1000μg。

14、在一些实施方案中，cpg寡核苷酸具有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且cpg寡核苷酸任选经由peg接头与至少一个亲脂性基团共价连接。

15、在一些实施方案中，tau磷酸肽以每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔，诸如每剂约29.7纳摩尔至约742.5纳摩尔，优选约90纳摩尔至约715纳摩尔，诸如每剂约89.1纳摩尔至约712.8纳摩尔，或每剂约90纳摩尔至约535纳摩尔，诸如每剂约89.1纳摩尔至约534.6纳摩尔，或每剂约90纳摩尔至约275纳摩尔，诸如每剂约89.1纳摩尔至约267.3纳摩尔的量施用。在某些实施方案中，tau磷酸肽由选自seq id no:27至seq id no:29和seq id no:31至seqid no:38的氨基酸序列组成，优选由seq id no:28的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，四棕榈酰化tau磷酸肽以每剂100μg至2500μg(对应于每剂29.7纳摩尔至742.5纳摩尔)，优选每剂300μg至2400μg(对应于每剂89.1纳摩尔至712.8纳摩尔)，诸如每剂300μg、900μg、1800μg或2400μg(对应于每剂89.1纳摩尔、267.3纳摩尔、534.6纳摩尔或712.8纳摩尔)的量施用。

16、在某些实施方案中，有效量的脂质体以每剂30μg至900μg，优选100μg至585μg的量包含toll样受体4激动剂。在某些实施方案中，有效量的脂质体以每剂30μg至900μg，优选100μg至585μg的量包含toll样受体激动剂3-脱酰基单磷酰基六酰基脂质a。

17、在某些实施方案中，有效量的脂质体以每剂25μg至625μg，优选75μg至550μg，诸如75μg至450μg的量包含辅助性t细胞表位。在某些实施方案中，有效量的脂质体以每剂25μg至625μg，优选75μg至450μg的量包含由seq id no:13的氨基酸序列组成的t50辅助性t细胞表位。在某些实施方案中，有效量的脂质体以每剂约2纳摩尔至约110纳摩尔，诸如每剂约4.02纳摩尔至约100.44纳摩尔，或每剂约4纳摩尔至约75纳摩尔，诸如每剂约4.02纳摩尔至约72.32纳摩尔，或每剂约10纳摩尔至约105纳摩尔，诸如每剂约12.06纳摩尔至约100.44纳摩尔，或每剂约70至约105纳摩尔，诸如每剂约72.32纳摩尔至约100.44纳摩尔的量包含辅助性t细胞表位。在某些实施方案中，有效量的脂质体以每剂约3纳摩尔至约105纳摩尔，优选每剂约10纳摩尔至约105纳摩尔，诸如每剂约12.06纳摩尔至约100.44纳摩尔的量包含由seq id no:13的氨基酸序列组成的t50辅助性t细胞表位。在一个实施方案中，有效量的脂质体以每剂2至5纳摩尔，例如每剂2、3、4或5纳摩尔或其间的任意值，诸如每剂约3.82、3.92、4.02或4.12纳摩尔的量包含辅助性t细胞表位。在另一实施方案中，有效量的脂质体以每剂10至15纳摩尔，诸如每剂10、11、12、13、14或15纳摩尔，或其间的任意值，诸如每剂11.86、11.96、12.06、12.16纳摩尔的量包含辅助性t细胞表位。在另一实施方案中，有效量的脂质体以每剂70至75纳摩尔，诸如每剂70、71、72、73、74或75纳摩尔，或其间的任意值，诸如每剂72.02、72.12、72.22、72.32、72.42纳摩尔的量包含辅助性t细胞表位。在再一实施方案中，有效量的脂质体以每剂98至103纳摩尔，诸如每剂98、99、100、101、102或103纳摩尔，或其间的任意值，诸如每剂100.24、100.34、100.44、100.54或100.64纳摩尔的量包含辅助性t细胞表位。

18、在某些实施方案中，有效量的脂质体以每剂50μg至1250μg，优选100μg至1000μg，诸如150μg至800μg的量包含脂质化cpg寡核苷酸。在某些实施方案中，有效量的脂质体以每剂50μg至1250μg，优选150μg至800μg的量包含由seq id no:18的核苷酸序列组成的cpg寡核苷酸。

19、在某些实施方案中，脂质体皮下施用。

20、在某些实施方案中，脂质体肌内施用。

21、在某些实施方案中，脂质体进一步包含一种或多种选自1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酰基-3’-rac-甘油(dmpg)和胆固醇的脂质。

22、在某些实施方案中，脂质体包含：

23、(1)具有seq id no:28的氨基酸序列的tau磷酸肽；

24、(2)包含3-脱酰基单磷酰基六酰基脂质a的toll样受体4激动剂；

25、(3)包含seq id no:39的氨基酸序列的辅助性t细胞表位；

26、(4)包含seq id no:18的核苷酸序列的脂质化cpg寡核苷酸；和

27、(5)至少一种选自1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酰基-3’-rac-甘油(dmpg)和胆固醇的脂质。

28、根据本技术的一个实施方案，抗体反应包含针对ptau的特异性igg抗体反应。优选地，特异性igg抗体反应具有为安慰剂对照的至少50、60、70、80、90、100或更多倍的抗ptauigg滴度。

29、在本技术的另一实施方案中，抗体反应包含针对ptau的特异性igm抗体反应和该特异性igm抗体反应向针对ptau的特异性igg抗体反应的类别转换。

30、在本技术的再一实施方案中，抗体反应包含相对于非磷酸化tau蛋白优先识别ptau的igg抗体反应。优选地，抗ptau igg滴度与抗tau igg滴度的比率为至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70或更高。

31、在本技术的另一实施方案中，抗体反应包含针对富集成对螺旋丝(ephf)的igg抗体反应。优选地，igg抗体反应具有为安慰剂对照的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多倍的抗ephf igg滴度。更优选地，抗ephf igg在初始施用有效量的脂质体后至少6周，或在加强施用后(如在加强施用后至少2周所测量的)具有提高的对病理性ephf tau的结合亲合力，优选抗ephf igg具有至少0.3、0.4、0.5、0.6或0.7的亲合力指数。

32、根据本技术的实施方案，抗体反应可以通过加强施用来加强。

33、在一个实施方案中，本技术的方法进一步包括在初始施用有效量的脂质体后4至12周，诸如8周，向受试者施用第二剂量的有效量的脂质体。如施用第二剂量的有效量的脂质体后至少2周所测量的，抗体反应得到加强。优选地，如施用第二剂量的有效量的脂质体后至少2周所测量的，抗体反应加强至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。

34、在另一实施方案中，本技术的方法进一步包括在初始施用有效量的脂质体后20至28周，诸如24周，向受试者施用第三剂量的有效量的脂质体。如施用第三剂量的有效量的脂质体后至少2周所测量的，抗体反应得到加强，优选如施用第三剂量的有效量的脂质体后至少2周所测量的，抗体反应提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。

35、在再一实施方案中，本技术的方法进一步包括在初始施用有效量的脂质体后44至52周，诸如48周，向受试者施用第四剂量的有效量的脂质体。在施用第四剂量的有效量的脂质体后至少2周，抗体反应得到加强，优选地，通过施用第四剂量的有效量的脂质体，抗体反应提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。

36、在某些实施方案中，人受试者需要清除tau的聚集体。在某些实施方案中，受试者需要预防或治疗阿尔茨海默病，诸如临床前阿尔茨海默病、早期阿尔茨海默病、由阿尔茨海默病引起的轻度认知障碍(mci)、轻度阿尔茨海默病、或轻度至中度阿尔茨海默病。在另一些实施方案中，受试者的脑中呈淀粉样蛋白阳性，但尚未显示出显著的认知障碍。

37、本发明还涉及用于在有需要的人受试者中诱导免疫反应，诸如针对磷酸化tau蛋白(ptau)的抗体反应的疫苗组合，其中疫苗组合包含根据本发明的实施方案的初免疫苗和加强疫苗，并且免疫反应在向人受试者施用初免疫苗后持续至少10周，诸如至少10、15、20、25、30、35、40、45、50周或更长。

38、在阅读本发明的以下详述和权利要求后将更好地理解本发明的进一步的方面、特征和优点。