一种提高三角褐指藻异养转化株葡萄糖异养生长速率的方法与应用

本发明属于合成生物学领域，涉及微藻葡萄糖代谢途径的改造，具体涉及一种提高三角褐指藻异养转化株葡萄糖异养生长速率的方法与应用。

背景技术：

1、本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、三角褐指藻(phaeodactylum tricornutum)属硅藻门，细胞呈卵型，其细胞外壳只有一个硅质壳面无壳环带。三角褐指藻以富含不饱和脂肪酸epa和岩藻黄素而闻名，岩藻黄素是类胡萝卜素中的一种天然色素，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、促进脂肪分解和保护神经细胞等作用，因此三角褐指藻在药物、护肤产品以及保健品领域都得了广泛应用。另外硅藻表面具有纳米级别微孔的硅质壳面是目前所知唯一天然生产的纳米材料，硅藻介孔材料有着许多优异特性，具有很好的热稳定性、高生物适应性和低毒性等，在大分子催化、生物过程、选择吸附、功能材料等方面有着广泛的应用前景。

3、目前的硅藻介孔材料主要提取自远古硅藻沉积产生的矿物原料，这种资源存量有限无法短期再生并且纯化工艺复杂，因此通过人工培养获得的三角褐指藻有望成为材料领域优质原料的重要来源。但三角褐指藻的生长速率慢并且对环境的适应能力较弱导致目前自养培养模式下的产能很低，于是有研究者通过转入外源葡萄糖转运体基因glut1实现三角褐指藻转化株由纯自养生长向可异养生长的转化，但转化株的异养生长速率依然无法满足规模化生产的需要，因此优化三角褐指藻异养转化株的葡萄糖代谢途径是实现其异养生长速率提升的重要途径。然而发明人发现，目前尚未有对三角褐指藻异养转化株葡萄糖代谢途径的研究，而对三角褐指藻葡萄糖代谢途径进行改造的研究也鲜有报道。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种提高三角褐指藻异养转化株葡萄糖异养生长速率的方法与应用。本发明以三角褐指藻为具体研究对象，通过代谢物组学确定导致三角褐指藻glut1基因异养转化株异养条件下葡萄糖代谢过程中的限速位点，利用基因工程的相关技术手段对异养转化株的葡萄糖代谢途径进行优化，从而确定导致三角褐指藻转化株异养生长缓慢的原因并通过优化限速酶的表达提高异养转化株的异养生长速率。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、本发明的第一个方面，提供一种提高三角褐指藻异养转化株葡萄糖异养生长速率的方法，所述方法包括：通过对出发藻株即三角褐指藻异养转化株糖代谢途径中的异养生长限速酶基因进行过表达，提高三角褐指藻的异养生长速率；其中，所述异养生长限速酶包括但不限于磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸内酯酶。本发明通过研究发现，导致转化株异养生长缓慢的原因在于6-磷酸葡萄糖(g6p)的过量积累，同时根据代谢物组数据确定了导致g6p过量积累的关键限速酶的种类。通过过表达上述关键限速酶，从而有效解除了三角褐指藻异养转化株的内在限速节点，从而大幅提升了三角褐指藻的异养生长速率。

3、其中，所述出发藻株三角褐指藻异养转化株可以为任意具有异养生长性能的三角褐指藻藻株，在本发明的一个具体实施方式中，所述出发藻株可以为野生型三角褐指藻通过转入葡萄糖转运体后能利用葡萄糖进行异养生长的三角褐指藻异养转化株，具体的，可通过转入外源葡萄糖转运体基因glut1实现。

4、本发明的第二个方面，提供一株基因工程藻株，所述基因工程藻株具体通过上述方法构建获得；具体的，所述基因工程藻株是通过向出发藻株即三角褐指藻异养转化株转入重组表达载体后构建获得。

5、本发明的第三个方面，提供上述方法和/或基因工程藻株在如下任意一种或多种中的应用：

6、a)调控微藻生长速率；

7、b)调控微藻代谢途径。

8、需要说明的是，上述技术方案虽然以三角褐指藻为例，通过对藻株糖代谢途径中的异养生长限速酶基因进行过表达，从而提高三角褐指藻的异养生长速率，基于上述发明构思，对其他微藻(包括异养改造和非异养改造)的代谢途径优化同样亦属于本发明的保护范围之内。

9、上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

10、上述技术方案首次对三角褐指藻异养转化株的糖代谢物组进行分析，确定了导致转化株异养生长缓慢的原因在于g6p的过量积累，同时根据代谢物组数据确定了导致g6p过量积累的关键限速酶的种类。通过本技术方案的实施，解除了三角褐指藻异养转化株的内在限速节点，大幅提升了三角褐指藻的异养生长速率，相比出发藻株，本技术方案获得的三角褐指藻基因工程藻株的异养生长速率提高了接近50％，具有极为显著的有益效果。

11、上述技术方案为异养改造后微藻不同培养条件下代谢途径的研究提供借鉴经验，也为进一步提高异养转化株的生长速率提供有效的思路与方法参考，因此具有良好的实际应用价值。

技术特征：

1.一种提高三角褐指藻异养转化株葡萄糖异养生长速率的方法，其特征在于，所述方法包括：通过对出发藻株即三角褐指藻异养转化株糖代谢途径中的异养生长限速酶基因进行过表达，提高三角褐指藻的异养生长速率；其中，所述异养生长限速酶包括磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸内酯酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述出发藻株三角褐指藻异养转化株为任意具有异养生长性能的三角褐指藻藻株，进一步的，所述出发藻株为野生型三角褐指藻通过转入葡萄糖转运体后能利用葡萄糖进行异养生长的三角褐指藻异养转化株，具体的，通过转入外源葡萄糖转运体基因glut1实现。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达具体通过增加基因组中藻株自身的异养生长限速酶基因数量或者向基因组中转入其他物种的同源酶或同工酶基因实现；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸果糖激酶基因为编码佐夫色绿藻磷酸果糖激酶基因czpfk1，其具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；以及编码佐夫色绿藻磷酸果糖激酶基因czpfk2，其具有如seq id no.2所示的核苷酸序列；

5.一株基因工程藻株，其特征在于，所述基因工程藻株具体通过权利要求1-4任一项所述方法构建获得。

6.如权利要求5所述基因工程藻株，其特征在于，所述基因工程藻株是通过向出发藻株即三角褐指藻异养转化株转入重组表达载体后构建获得。

7.如权利要求6所述基因工程藻株，其特征在于，所述重组表达载体是将异养生长限速酶基因与表达载体连接获得；

8.如权利要求7所述基因工程藻株，其特征在于，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种；进一步的，所述表达载体为质粒，包括ppha-t1载体质粒。

9.如权利要求6所述基因工程藻株，其特征在于，转入方法包括生物学上可接受的直接转化法(包括基因枪法、电击法、超声波法、显微注射法、peg法)或者间接转化法(包括dna病毒载体介导法、农杆菌介导法)；进一步的，所述转入方法为基因枪法。

10.权利要求1-4任一项所述方法和/或权利要求5-9任一项所述基因工程藻株在如下任意一种或多种中的应用：

技术总结本发明属于合成生物学领域，涉及微藻葡萄糖代谢途径的改造，具体提供一种提高三角褐指藻异养转化株葡萄糖异养生长速率的方法与应用。本发明以三角褐指藻为具体研究对象，通过代谢物组学确定导致三角褐指藻Glut1基因异养转化株异养条件下葡萄糖代谢过程中的限速位点，利用基因工程的相关技术手段对异养转化株的葡萄糖代谢途径进行优化，从而确定导致三角褐指藻转化株异养生长缓慢的原因并通过优化限速酶的表达提高异养转化株的异养生长速率。相比出发藻株，本发明基因工程藻株的异养生长速率提高了接近50％。本发明为异养改造后微藻不同培养条件下代谢途径的研究提供借鉴经验，也为提高异养转化株的生长速率提供有效的思路与方法参考。技术研发人员：刘天中,张文蕾,周文俊,陈林,高莉丽受保护的技术使用者：中国科学院青岛生物能源与过程研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/18