西瓜叶形裂刻程度性状的KASP分子标记及其用途

本发明属于蔬菜品质性状分子标记开发和分子标记辅助育种，适用于西瓜叶片不同程度裂刻表型的快速筛选和分子标记辅助育种，具体提供一种新型且简便的西瓜叶形裂刻程度性状的kasp分子标记及其用途。

背景技术：

1、植物叶片是光合作用的重要场所，也是植物感知光、温、水等环境变化的重要器官。叶形多样性的主要因素即为叶片边缘形态的变化，主要有全缘、锯齿状、裂刻深浅。这些叶片形态的变化是植物适应环境的表现，具有重要的生物学意义。叶缘裂刻能调节叶面温度和水分流失，对干旱、高温等逆境胁迫表现出更强的适应性。此外，叶形特征是有效的形态标记，在苗期就可区分亲本和杂种，确保种子的纯度。西瓜(citrullus lanatus)是一种重要的园艺作物，大多数西瓜品种都有裂叶，但不同品种叶片裂叶的程度并不相同。因此，进一步阐明西瓜叶形裂刻程度和形态建成的遗传规律、定位与西瓜叶形裂刻程度相关功能基因可以为西瓜叶形的改良提供理论基础。

2、叶边缘形态多样性受到多种环境因素和遗传因子的共同影响。叶缘形态的遗传发育是在复杂的基因调控网络作用下形成的，涉及众多的基因、转录因子、激素、小rna等。关于叶边缘形态建成的发育调控机制，在拟南芥(arabidopsis thaliana)、碎米荠(cardamine hirsuta)、烟草(nicotiana tabacum)、番茄(solanum lycopersicum)、苜蓿(medicago truncatula)、豌豆(pisum sativum)等模式植物中已有大量的研究报道。目前，有研究报道西瓜的裂叶性状由单个显性等位基因clll1控制，定位在第4号染色体标记w08314和w07061之间的127.6-kb区域内(wei c h, chen x e, wang z y, et al. 2017.genetic mapping of the lobed leaf 1 (clll1) gene to a 127.6-kb region inwatermelon (citrullus lanatus l.). plos one [j], 12)。然而，对西瓜叶形裂刻程度的遗传分析与功能基因定位的研究较少，从而导致在应用上缺乏与西瓜叶形裂刻程度性状紧密连锁且实用性强的分子标记来辅助西瓜育种的工作。因此，在利用西瓜分子标记辅助叶形裂刻程度性状选择及品种育种方面，仍需进一步确定调控西瓜叶形裂刻程度的目标基因，并开发稳定高通量的分子标记。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种西瓜叶形裂刻程度性状的kasp分子标记及其用途，所述的kasp分子标记clll (lobed leaf)与西瓜叶形裂刻程度的性状紧密连锁，该分子标记能用于筛选不同西瓜叶片裂刻材料以及用于其后代的辅助选择育种。

2、本发明的第一方面，提供了一种基于bsa混池测序定位西瓜叶形裂刻程度性状基因用于鉴定不同西瓜叶形裂刻程度的kasp分子标记；

3、所述kasp分子标记为snp标记，位于西瓜4号染色体的24042401 bp处；分子标记位点前后50 bp序列如seq id no.1所示：

4、tgttctgtaaactcattaatatagaaggtgagagagagagagagagagagnggggggtttgtaattgtgggtgaagagggaaacatgaaaatccaaataa

5、其中下划线n对应的是snp位点，n的基因型是a/g，a基因型对应的表型为浅裂刻，g基因型对应的表型为深裂刻。

6、本发明的第二方面，提供了西瓜中叶形裂刻程度性状连锁的单核苷酸多态性鉴定方法，包括以下步骤：

7、(1) 以叶片深裂刻西瓜材料zju145和浅裂刻西瓜材料zju116为亲本进行杂交，然后自交，构建遗传分离群体f2，从而获得不同叶形裂刻程度分离的f2单株；

8、(2) 用ctab(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取西瓜亲本幼苗及杂交后代f2群体幼苗基因组dna；

9、(3) 采用bsa(分离群体分析，bulked segregant analysis)定位与西瓜叶形裂刻程度性状相关的区域或基因。

10、(4) 鉴定与西瓜叶形裂刻程度性状紧密连锁的单核苷酸多态性序列。

11、本发明的第三方面，还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：

12、(1) 以叶片深裂刻西瓜材料zju145和浅裂刻西瓜材料zju116为亲本进行杂交，然后自交，从而获得不同叶形裂刻程度分离的f2群体；

13、(2) 用ctab(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取西瓜亲本幼苗及杂交后代f2群体幼苗基因组dna；

14、(3) 挑选f2群体中极端叶片裂刻的材料构建深裂刻和浅裂刻混池，采用bsa(分离群体分析，bulked segregant analysis)定位与西瓜叶形裂刻程度性状相关的区域。

15、(4) 鉴定与西瓜叶形裂刻程度性状紧密连锁的snp变异和indel插入缺失变异。

16、(5) 基于连锁的变异，采用kasp (竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应，kompetitive allele specific polymerase chain reaction)方法进行西瓜叶形裂刻程度性状分子标记的筛选；

17、(6) 开发出一个与西瓜叶形裂刻程度性状紧密连锁的kasp分子标记clll。

18、本发明的第四方面，提供了一种检测所述西瓜叶形裂刻程度性状的kasp分子标记的试剂在鉴定西瓜叶形裂刻程度中的用途。

19、进一步地，用于为不同西瓜叶形裂刻程度材料或其后代的分子辅助选择育种。

20、进一步地，检测所述西瓜叶形裂刻程度性状的kasp分子标记的试剂包含引物组合，引物组合包括：

21、正向引物f1：

22、5’-gaaggtgaccaagttcatgctccacaattacaaacccccct-3’

23、正向引物f2:

24、5’-gaaggtcggagtcaacggattccacaattacaaaccccccc-3’

25、反向引物r：

26、5’-aaaaaaaaaggattctcaaaagcgc-3’。

27、kasp分子标记引物组合可委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

28、进一步地，采用上述引物组合鉴定鉴定西瓜叶形裂刻程度，具体是：

29、（1）提取待测西瓜样本基因组dna；

30、（2）利用所述的引物组合对获得的基因组dna在abi step one pcr仪上进行pcr扩增；

31、（3）检测pcr扩增结果的荧光信号判断待测西瓜的叶形裂刻程度，其中，若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f1的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型aa，表型为深裂刻，若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f2的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型gg，表型为浅裂刻；若pcr扩增结果荧光信号颜色均与正向引物f1、正向引物f2的荧光接头颜色不同，则为杂合基因型。

32、进一步地，所述步骤（2）中，pcr扩增使用的pcr反应体系为：20-50 ng/μl西瓜基因组dna 5.0 μl，kasp master mix 5.0 μl，kasp assay mix(f1：f2：r＝2:2:5的体积比，三种引物浓度均为10 ng/μl)0.14 μl，总体积为10.14 μl；

33、进一步地，所述步骤（2）中，pcr扩增使用的pcr反应程序为：30℃，1分钟（读取荧光信号）；94℃，15分钟（预变性）；94℃，20秒（变性）；61℃（-0.6℃/循环）退火60秒，10个循环；94℃，20秒（变性）；55℃，退火60s秒，35个循环。30℃，1分钟（读取荧光信号）。

34、扩增结束后，检测荧光信号并分析基因分型情况。若分型不充分，则可以继续扩增。94℃，20秒（变性）；55℃，退火60s秒，3个循环。30℃，1分钟（读取荧光信号）。每增加3个循环读取荧光信号查看分型情况，直至完全分型。

35、本发明的有益效果是，利用上述分子标记可以开展西瓜叶形裂刻程度性状分子辅助选择育种。将深裂刻材料zju145和浅裂刻材料zju116进行杂交，然后回交、自交结合分子标记辅助选择，极大提高了辅助选择的效率。设计开发的与西瓜叶形裂刻程度性状紧密连锁的kasp分子标记，可以在苗期鉴定杂种，进行西瓜不同叶形裂刻程度材料的初步筛选，以达到分子标记辅助育种的目的。