一种重组猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc(KiH)的融合蛋白及其应用的制作方法
- 国知局
- 2024-06-20 10:44:24
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种重组猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪fc(kih)的融合蛋白及其应用。
背景技术:
1、常见猪病毒性疫病有非洲猪瘟、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病和猪圆环等。目前对于这类疫病主要通过生物安全措施和疫苗接种进行预防。然而由于基础研究不足、病毒变异、依赖于自身免疫系统状态等原因,许多疫病的疫苗效果并不理想。
2、猪流行性腹泻病毒(pedv)疫苗面临三个难题。首先,pedv是一种变异非常快的rna冠状病毒,尤其是s蛋白(中和抗体的主要靶标),变异最高,因此疫苗易失效。其次,pedv感染的仔猪死亡病程非常短,基本在出生7日内全部死亡,而疫苗注射后10天才开始产生抗体,因此对仔猪注射pedv疫苗没有效果。再次,怀孕母猪注射的pedv疫苗需要对通过胎盘和初乳将母源抗体传给仔猪,然而仔猪获得的母源抗体量有限,且个体间获得的母源抗体水平差异较大,所以效果很不稳定。
3、猪繁殖与呼吸综合症病毒(prrsv)也面临相似问题。prrsv是一种变异快、重组频繁的rna病毒。灭活疫苗对预防prrsv没有效果,减毒活疫苗也经常引起反强毒株的出现,导致原本对阴性猪场变成阳性猪场,引起prrsv传染病的爆发。此外,现已发现很多种prrsv病毒谱系,同一猪场可能同时存在多种毒株,难以选择适当的免疫方案。商业化的prrsv疫苗种类很多,但交叉保护有限,部分养殖户缺乏专业知识,导致疫苗的滥用和过度使用,猪群长期处于亚健康状态。
4、干扰素是细胞免疫系统中一类重要的细胞因子,主要分为干扰素ɑ,干扰素β,干扰素γ和干扰素λ。它们能够干扰病毒在感染宿主细胞过程中的复制和传播,从而对抗病毒感染。但天然干扰素的半衰期较短,血浆半衰期大约为2-6小时。融合蛋白技术可将具有生物活性的功能蛋白分子与白蛋白等分子融合产生新型蛋白分子。融合后的蛋白分子,半衰期延长,可以减少给药频率,方便操作人员使用的同时减少对仔猪的刺激,提高产品的适用性。
技术实现思路
1、为了解决上述的技术问题,对猪病毒性疫病进行高效的防治,本发明提供以下的技术方案。
2、第一方面,本发明提供一种重组猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪fc(kih)的融合蛋白,其由猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪fc(kih)连接而成。
3、优选地,所述猪fc由knobs链和holes链构成。
4、优选地,猪干扰素λ1、猪干扰素γ、猪fc中knobs链、猪fc中holes链相互之间通过linker连接或直接连接。
5、进一步地,所述linker是由2-20个柔性氨基酸组成的柔性多肽,所述柔性氨基酸选自gly、ser、ala、thr中的至少一种;优选地,所述linker为(gly-gly-gly-gly-ser)n,其中n为2-5之间的整数,更优选n为3。
6、优选地,猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪fc(kih)相互之间包括下列2种方式:
7、①猪干扰素λ1连接猪fc中knobs链、猪干扰素γ连接猪fc中holes链。
8、②猪干扰素γ连接猪fc中knobs链、猪干扰素λ1连接猪fc中holes链。
9、进一步优选地,猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪fc(kih)相互之间采用方式①连接。
10、优选地,所述融合蛋白是由seq id no:1和seq id no:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质,或由seq id no:3和seq id no:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
11、优选地,所述融合蛋白是由与seq id no:1和seq id no:2所示的氨基酸序列具有80%以上同一性的氨基酸组成且具有相同功能的蛋白质,或由与seq id no:3和seq id no:4所示的氨基酸序列具有80%以上同一性的氨基酸组成且具有相同功能的蛋白质。
12、上述的同一性是指氨基酸序列同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性,如ncbi主页网站的blast网页。
13、优选地,所述的80%以上同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
14、第二方面,本发明提供一种核苷酸分子,其编码第一方面所述的融合蛋白。
15、优选地,所述核苷酸分子包括dna和/或rna,例如重组dna,或mrna。
16、进一步优选地,所述核苷酸分子包括:
17、①seq id no:5和seq id no:6所示的碱基序列的组合。
18、②seq id no:7和seq id no:8所示的碱基序列的组合。
19、③seq id no:5和seq id no:6所示的碱基序列的组合的互补、简并或转录序列。
20、④seq id no:7和seq id no:8所示的碱基序列的组合的互补、简并或转录序列。
21、⑤与seq id no:5和seq id no:6所示的碱基序列的组合的互补、简并或转录序列限定的dna分子或mrna具有75%以上的同一性且编码所述融合蛋白中的相应蛋白的dna分子或mrna。
22、⑥与seq id no:7和seq id no:8所示的碱基序列的组合的互补、简并或转录序列限定的dna分子或mrna具有75%以上的同一性且编码所述融合蛋白中的相应蛋白的dna分子或mrna。
23、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法,例如定向进化和点突变的方法,对本发明的编码上述融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的,具有编码上述融合蛋白的核苷酸序列75%或更高同一性的核苷酸,只要编码上述融合蛋白且具有相同功能,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
24、所述同一性是指与比较的核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的seqid no:3-4所示的核苷酸序列具有75%或更高,具有80%或更高,或85%或更高,或90%或更高,或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
25、优选地,所述75%以上的同一性可以为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
26、第三方面,本发明提供一种载体,其包含第二方面所述的核苷酸分子。
27、所述载体是指能够把外源dna、mrna或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体,所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体,包括但不限于:质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。在本发明的一个具体实施方案中,所述载体为质粒pcdna3.4。
28、第四方面,本发明提供一种宿主细胞,其包含第二方面所述的核苷酸分子或第三方面所述的载体。
29、优选地,所述宿主细胞(也称为受体细胞)为真核细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞,而且也指这种细胞的后代,且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变,该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致,但仍包括在宿主细胞的范围中。
30、进一步优选地,所述宿主细胞可为植物细胞或动物细胞。合适的宿主细胞为本领域已知的。所述植物细胞可为拟南芥(arabidopsis thaliana)、烟草(nicotianatabacum)、玉米(zea mays)、水稻(oryza sativa)、小麦(triticum aestivum)等植物细胞但不限于此。所述动物细胞可为哺乳动物细胞,例如:中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、非洲绿猴肾细胞(vero细胞)、幼仓鼠肾细胞(bhk细胞)、小鼠乳腺癌细胞(c127细胞)、人胚胎肾细胞(hek293细胞)、人hela细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、t细胞、nk细胞、猪肾细胞(pk15细胞)、猪肺泡巨噬细胞(pam细胞)、猪小肠上皮细胞(ipec-1细胞)、猪睾丸细胞(st细胞)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(xenopus laevis)细胞或大鲵(andrias davidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如sf21细胞或sf-9细胞)等,但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中,所述宿主细胞为cho-k1细胞。
31、第五方面,本发明提供第一方面所述的融合蛋白的制备方法,所述制备方法包括将第二方面所述的核苷酸分子或第三方面所述的载体导入到宿主细胞,并从细胞或细胞培养物中回收第一方面所述的融合蛋白。
32、优选的,所述制备方法包括筛选表达量高且稳定的单克隆细胞株。
33、第六方面,本发明提供一种药物组合物,所述药物组合物包含第一方面所述的融合蛋白,或第二方面所述的核苷酸分子,或第三方面所述的载体,或第四方面所述的宿主细胞。
34、任选地,所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料和赋形剂。
35、第七方面,本发明提供上述任一融合蛋白、核苷酸分子、载体或宿主细胞的应用,所述应用包括以下任一种:
36、(1)在制备用于预防和/或治疗猪病毒性疫病产品中的应用;
37、(2)在用于诱导猪病毒抗原免疫反应的产品中的应用;
38、(3)在预防和/或治疗猪病毒疫病的应用;
39、(4)在用于诱导猪病毒抗原免疫反应中的应用;
40、优选地,所述猪病毒性为pedv或prrsv。
41、本发明的有益效果:
42、一、本发明的融合蛋白可以迅速激活猪体内免疫系统活力,激活抗病毒反应,有效对抗外来病毒入侵,预防猪病毒性疫病的发生。
43、二、本发明的融合蛋白可抑制病毒在猪体内的复制,可以破坏病毒结构,治疗猪病毒性疫病。
44、三、相较于现有的融合蛋白,本发明的融合蛋白的ed50值和ec50值低,药效更高,安全性更好,并且本发明的融合蛋白具有广谱抗病功能,可以安全高效地防控猪病毒性疫病。
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