一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液及其应用

本发明涉及动物繁殖育种领域，特别提供一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液及其应用。

背景技术：

1、性控技术（sex control）是指通过人为干预，使动物按照人们所希望的性别繁殖后代的技术，该技术主要是对x、y精子进行分选，采用分选后的精液授精，从而生产出符合预期性别的后代。

2、目前，根据x、y精子的大小、活力、电荷、表面抗原和dna含量等方面的差异，精子分选方法主要有密度梯度离心法、电泳法、蛋白免疫学分选法、流式细胞仪分选法等，但密度梯度离心法、电泳法、蛋白免疫学分选法都存在理论依据不足、重复性差、结果不可靠等问题，流式细胞仪分选法是目前最成功的对公牛精子进行性别分选较为成功的方法。然而，流式细胞仪分选法仍存在诸多弊端，例如，分选后精子活力和顶体完整精子的百分比明显下降，导致精子的生育能力减弱，人工授精后受胎率较低、对输精技术要求较高；其次，用于精子分选的流式细胞仪过于昂贵且分选速度慢，无法在个别农场或实验室获得，也不能满足生产上对性控精液的大量需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液及其应用，以解决上述分离方法所存在的问题，具体方案如下：

2、一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液，包括精子分选保护液和性控功能成分，其特征在于，所述精子分选保护液为：氯化钠、氯化钾、二水氯化钙、磷酸二氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、碳酸氢钠、青链霉素、酚红；

3、所述性控功能成分为：肌酸、24e药物；

4、所述肌酸的浓度为450 um-550 um；

5、所述24e药物的浓度为0.27 um-0.33 um；

6、所述24e药物为吡啶[3，2-d]嘧啶类tlr7&8双激动剂。

7、而且，每1000 ml精子分选保护液由氯化钠 6.902 g、氯化钾0.300 g、二水氯化钙0.330 g、磷酸二氢钠 0.097 g、葡萄糖2.500 g、丙酮酸钠0.138 g、碳酸氢钠 3.105 g、青链霉素2.5 ml、酚红400 ul和去离子水配制而成。

8、而且，每1000 ml精子分选保护液内加入24e药物98.41ug-120.28ug、加入肌酸59.01mg-72.12mg。

9、而且，所述24e药物的分子式为c21h28n6，分子结构式如图6所示。

10、而且，一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液的使用方法如下：

11、（1）、将采集的新鲜牛精液检测活力后使用精子分选保护液稀释后离心，去除上清液后使用牛性控精子分选液重悬精子；

12、（2）、35℃-40℃条件下静置孵育60 min-90 min，得到孵育后的分层精液；

13、（3）、将上述分层精液分离，得到上清液和沉淀，所述上清液为y精液，所述沉淀为x精液；

14、（4）、使用精子分选保护液将y精液、x精液中的药物分别洗脱后，得到用于体外受精、人工授精、胞质内精子注射任一种用途的y性控精液、x性控精液。

15、而且，采用实时荧光定量pcr技术验证所述小分子化合物介导的牛性控精子分选液的分选效果所使用的引物，分别为y染色体特异性基因sry基因引物对、x染色体特异性基因plp基因引物对、内参基因gapdh基因引物对，所述y染色体特异性基因sry基因引物对为sry-f和sry-r，所述sry-f的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述sry-r的核苷酸序列如seq id no.2所示；

16、所述x染色体特异性基因plp基因引物对为plp-f和plp-r，所述plp-f的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述plp-r的核苷酸序列如seq id no.4所示；

17、所述内参基因gapdh引物对为gapdh-f和gapdh-r，所述gapdh-f的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述gapdh-r的核苷酸序列如seq id no.6所示。

18、另一方面，本发明还提供了一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液的应用，用于鉴定公牛精子种类。

19、而且，用于制备鉴定公牛精子种类的试剂盒。

20、而且，用于分选或筛选公牛x、y精子。

21、而且，用于制备分选或筛选公牛x、y精子的试剂盒。

22、有益效果：

23、1、利用本发明所提供的一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液进行x、y精子分选的方法简单易行，能够满足生产中对性控精液的大量需求；而且分选过程是在精子所适宜条件下进行的且不需要对精子进行复杂的处理，因此分选所花费的时间少，对精子产生的伤害小，不影响精子的生育能力，人工授精后受胎率较高，对输精技术要求较低。

24、2、本发明提供的24e药物的激活选择性地抑制了x精子的活动性，而对y精子没有作用，但没有改变精子的生存能力或顶体的形成，精子活力的差异使得y精子和x精子得以分离；而肌酸能够促进精子的运动，从而使y精子更快上浮，分层更加明显，提高了分选效率。

25、3、实验研究发现，在睾丸中的圆形精子和附睾中的成熟精子中均有约50%的精子表达tlr7&8，并且经过转录组学和蛋白质组学进一步验证了tlr7&8表达发生在x精子上，而在y精子并不表达，其中，tlr7定位于尾部，tlr8定位于中段，激活tlr7和tlr8不仅抑制了己糖激酶活性，还抑制了精子中的线粒体活性，从而减弱了糖酵解途径以及三羧酸循环，进而减少了atp的生成，致使x精子活力下降，从而实现性控精子的分选。

技术特征：

1.一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液，包括精子分选保护液和性控功能成分，其特征在于，所述精子分选保护液为：氯化钠、氯化钾、二水氯化钙、磷酸二氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、碳酸氢钠、青链霉素、酚红；

2.如权利要求1所述的一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液，其特征在于，每1000 ml所述精子分选保护液由氯化钠 6.902 g、氯化钾0.300 g、二水氯化钙0.330 g、磷酸二氢钠0.097 g、葡萄糖2.500 g、丙酮酸钠0.138 g、碳酸氢钠3.105 g、青链霉素2.5 ml、酚红400 ul和去离子水配制而成。

3.如权利要求2所述的一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液，其特征在于，每1000 ml所述精子分选保护液内加入24e药物98.41ug-120.28ug。

4.如权利要求3所述的一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液，其特征在于，每1000 ml所述精子分选保护液内加入肌酸59.01mg-72.12mg。

5.如权利要求4所述的一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液，其特征在于，使用方法如下：

6.如权利要求1-5任一项所述的小分子化合物介导的牛性控精子分选液的应用，其特征在于，用于鉴定公牛精子种类。

7.如权利要求1-5任一项所述的小分子化合物介导的牛性控精子分选液的应用，其特征在于，用于制备鉴定公牛精子种类的试剂盒。

8.如权利要求1-5任一项所述的小分子化合物介导的牛性控精子分选液的应用，其特征在于，用于分选或筛选公牛x、y精子。

9.如权利要求1-5任一项所述的小分子化合物介导的牛性控精子分选液的应用，其特征在于，用于制备分选或筛选公牛x、y精子的试剂盒。

技术总结本发明提供一种小分子化合物介导的牛性控精子分选液及其应用，包括精子分选保护液和性控功能成分，所述精子分选保护液为：氯化钠、氯化钾、二水氯化钙、磷酸二氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、碳酸氢钠、青链霉素、酚红；所述性控功能成分为：肌酸、24e药物；所述肌酸的浓度为450 uM‑550 uM；所述24e药物的浓度为0.27 uM‑0.33 uM；所述24e药物为吡啶[3，2‑d]嘧啶类TLR7&8双激动剂；本发明能够满足生产中对性控精液的大量需求，而且分选过程是在精子所适宜条件下进行的且不需要对精子进行复杂的处理，分选花费时间少，对精子产生伤害小。技术研发人员：杨磊,王德政,李光鹏,狄安琪,宋丽爽,白春玲,刘雪霏受保护的技术使用者：内蒙古大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13