一种可降解玉米赤霉烯酮的融合酶在玉米副产物中的应用

本发明涉及一种可降解玉米赤霉烯酮的融合酶在玉米副产物中的应用，属于微生物和食品安全领域。

背景技术：

1、玉米赤霉烯酮(zen)，也称为f-2毒素，是一种非甾体雌激素霉菌毒素，最初在发霉的玉米中发现，主要分布在玉米和谷物中。zen由一些常见的土壤真菌生物合成，如禾谷镰刀菌(也称为玉米赤霉菌)、禾谷镰刀菌、马氏镰刀菌、弯曲镰刀菌和半构造镰刀菌。通常，zen表现为白色颗粒，具有优良的热稳定性，可溶于氯仿、醇类和一些碱性溶液。因此，zen对环境温度变化不敏感，在食品或饲料的加工和储存过程中难以降解。例如，玉米谷粒在生长、收获、储藏环节会受到不同程度的霉菌毒素污染，加工过程中霉菌毒素会分散至各类副产物。在加工玉米过程中可产生玉米浆、胚芽粕、玉米蛋白粉、玉米麸皮饲料等副产物，这些副产物具有价格低廉、营养丰富等特点，具有较大的利用潜力，通常会用作动物饲料。饲料原料中的霉菌毒素残留会严重危害动物的生长性能及免疫能力。除此以外，由于其结构与17-β-雌二醇和其他天然雌激素的结构相似，zen可以与体内的天然雌激素竞争性地与雌激素受体结合，发挥雌激素样作用，破坏体内雌激素水平，并引起生殖系统疾病。此外，已知zen具有免疫毒性、肝毒性、血液毒性、遗传毒性、致畸性和致癌性。因此，解决zen造成的污染已成为食品和饲料行业最关心的问题之一。

2、谷物中真菌毒素的降解通常通过物理、化学和生物方法实现。与物理和化学方法相比，生物酶消化更具针对性、便捷性和环保性。生物酶解毒涉及利用负责微生物毒素降解的关键基因。通过基因工程的应用，培育出能高效表达这些生物酶的优化菌群，然后分离出纯酶，消除食品和饲料中的真菌毒素。在zen解毒酶中，内酯水解酶是研究最深入、应用最广泛的酶。zhd518内酯水解酶是一种中性的zen降解酶，与其他内酯相比，它不需要高碱性的环境来达到最佳的酶活性，使其成为食品工业中zen降解酶的更好候选。然而，zhd518和其他新发现的酶面临的主要挑战是它们的降解效率低，在高温下稳定性降低。这不仅影响了内酯酶在实际阳性样品中的降解能力，而且极大地影响了其与现有食品和饲料加工步骤的相容性。

技术实现思路

1、本发明提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶的融合酶，具有s1v1-gs-zhd518所示结构的多肽序列；其中，s1v1为aeaeahahaeaeahah；gs为gs连接肽；zhd518为氨基酸序列如genbank登录号：xm_013418296.1所示的玉米赤霉烯酮降解酶。

2、在一种实施方式中，所述融合酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明还提供了编码所述融合酶的基因。

4、在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、本发明还提供了一种产所述融合酶的重组大肠杆菌。

6、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pet22b为表达载体，表达seq id no.1所示的融合酶。

7、本发明还提供了制备所述融合酶的方法，所述方法包括：培养所述重组大肠杆菌，收集细胞培养液中的融合酶。

8、在一种实施方式中，所述方法是将所述重组大肠杆菌在lb培养基中培养一段时间，用iptg诱导，收集菌体中的融合酶。

9、在一种实施方式中，所述方法还包括破碎细胞、收集上清液中的酶和纯化步骤。

10、在一种实施方式中，所述诱导是当培养至菌液od600＝0.5-0.7时，加入诱导剂iptg，使终浓度为0.1-0.5mm，在14-18℃、100-200rpm诱导12-36h。

11、本发明还提供了所述玉米赤霉烯酮降解酶的融合酶s1v1-gs-zhd518在玉米赤霉烯酮降解中的应用。

12、在一种实施方式中，所述应用是降解玉米副产物中的玉米赤霉烯酮。

13、在一种实施方式中，所述玉米副产物包括但不限于玉米皮、玉米胚芽粕或玉米蛋白粉。

14、在一种实施方式中，所述的反应ph为3.0-10.6。

15、在一种实施方式中，所述的反应温度为25-60℃。

16、在一种实施方式中，所述的反应温度和反应时间为40,45,50,55,60℃和5、10、15、30min。

17、在一种实施方式中，所述应用具体包括：从小型玉米加工作坊获得的玉米胚芽粕、玉米皮和玉米蛋白粉经过研磨，并通过40目筛网进行均匀筛分。将含有目标蛋白的pbs溶液置于冻干机中，经过一夜干燥得到固体目标蛋白。酶解zen时，将纯化的s1v1-gs-zhd518酶200μg加入到5g玉米副产物和20ml pbs(ph 7.5)的混合物中进行反应。

18、在一种实施方式中，所述的玉米胚芽粕、玉米皮和玉米蛋白粉经过粉碎后过40目筛。

19、在一种实施方式中，所述的s1v1-gs-zhd518酶是冻干后的固体酶制剂。

20、在一种实施方式中，所述的反应温度是45℃。

21、在一种实施方式中，所述的反应时间是15、30、60min。

22、本发明还提供了所述玉米赤霉烯酮降解酶的融合酶在食品或饲料加工领域中的应用。

23、有益效果：

24、本发明提供了一种含有玉米赤霉烯酮内酯水解酶zhd518的重组酶s1v1-gs-zhd518，可进一步提升zhd518酶的活性、表达量和热稳定性，所述重组酶s1v1-gs-zhd518与原始酶zhd518相比，其蛋白表达量提高了1.28倍、酶活提高了9.27倍，45℃10min热稳定性提高了37.08倍。具有较大的应用前景。

25、本发明还提供了一种高效降解玉米皮、玉米胚芽粕和玉米蛋白粉等玉米副产物中玉米赤霉烯酮的方法，配合特定的降解条件，能够使得玉米赤霉烯酮的脱除率分别达90.975％、91.004％和95.32％

技术特征：

1.一种玉米赤霉烯酮降解酶的融合酶，其特征在于，具有s1v1-gs-zhd518所示结构的多肽序列；其中，s1v1为aeaeahahaeaeahah；gs为gs连接肽；zhd518的氨基酸序列如genbank登录号：xm_013418296.1所示。

2.根据权利要求1所述的融合酶，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.编码权利要求1或2所述融合酶的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.2所示。

5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以pet22b为表达载体，表达seq id no.1所示的融合酶。

6.一种制备权利要求2所述融合酶的方法，其特征在于，培养权利要求5所述的重组大肠杆菌，收集细胞培养液中的融合酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将权利要求5所述的重组大肠杆菌在lb培养基中培养一段时间，用iptg诱导，收集菌体中的融合酶。

8.权利要求1或2所述的融合酶在玉米赤霉烯酮降解中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是降解玉米副产物中的玉米赤霉烯酮；所述玉米副产物包括但不限于玉米皮、玉米胚芽粕或玉米蛋白粉。

10.权利要求1或2所述的融合酶，或权利要求5所述的重组大肠杆菌在食品或饲料加工领域中的应用。

技术总结本发明公开了一种可降解玉米赤霉烯酮的融合酶在玉米副产物中的应用，属于微生物和食品安全领域。本发明提供了玉米赤霉烯酮内酯水解酶融合酶S1v1‑GS‑ZHD518，通过融合S1v1短肽提高了ZHD518内酯酶的活性、表达量和热稳定性。本发明将融合酶S1v1‑GS‑ZHD518应用于阳性样本中玉米赤霉烯酮的降解，该酶能够适应加工环境中的高温条件并且可高效降解玉米赤霉烯酮，在1h内对玉米麸皮、玉米胚芽粕和玉米蛋白粉中ZEN的降解率分别为90.975％、91.004％和95.32％，具有较大的应用前景。技术研发人员：孙秀兰,方金培,孙嘉笛,叶永丽,纪剑,盛利娜,张银志受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18