组蛋白乙酰化在调控ZFP42基因转录中的应用

本发明属于细胞工程和基因工程，特别涉及组蛋白乙酰化在调控zfp42基因转录中的应用。

背景技术：

1、表观遗传学调控在生物发育的时空发展中起着重要的生物作用。它在保留原有dna序列的情况下通过改变组蛋白和dna的相互作用，从而限制性地调控基因的表达。组蛋白修饰作为表观遗传机制的一部分，是组蛋白尾部的n端受到共价修饰的过程。可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等组蛋白修饰过程。组蛋白乙酰化和去乙酰化修饰是一个动态可逆的过程，这种修饰与转录激活有关。组蛋白乙酰化状态由组蛋白乙酰化酶(histoneacetyltransferases，hats)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，hdacs)控制，是研究的最广泛的组蛋白修饰之一。

2、在hdacs作用时，组蛋白上的乙酰基则被转移，使得组蛋白上的赖氨酸残基带正电，带负电的dna重新紧紧地缠绕在组蛋白上，阻止转录因子的接近。hdac1，hdac2，hdac3属于i类hdac。不同hdac对卵巢癌具有不同作用。即在卵巢癌细胞中，hdac1在细胞增殖中起重要作用，hdac3在细胞粘附和迁移中起作用，hdac2与细胞中染色质变化和dna损伤反应有关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以作为癌症治疗的靶点，也可以促进表观遗传重塑和多能性相关基因的表达。与遗传缺陷相反，表观遗传畸变是可逆的。这种特征代表，表观遗传可以作为治疗的一个关键靶点。tsa这类组蛋白去乙酰化酶抑制剂已被fda批准用于临床方面。

3、zfp42是一个哺乳动物中特异表达的基因，作为胚胎干细胞标志物被广泛研究。zfp42可以在胚胎的发育过程中表达，也可以协同hdac调控muerv-l逆转录病毒元件，在成熟卵母细胞中频繁转录。但是，组蛋白乙酰化调控zfp42转录调控的机制仍未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供组蛋白乙酰化在猪卵巢颗粒细胞中调控zfp42和/或h3k27ac的应用。

2、本发明的目的通过下述技术方案实现：

3、组蛋白乙酰化在猪卵巢颗粒细胞中调控zfp42和/或h3k27ac的应用，通过如下任意一种或多种方式实现：

4、体外环境下，组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa能够促进猪卵巢颗粒细胞中zfp42和/或h3k27ac的表达；

5、抑制hdac2的表达的试剂能够促进猪卵巢颗粒细胞zfp42基因的表达、转录和翻译；

6、提高zfp42启动子-1574/-1829bp区域(p4区域)上h3k27ac乙酰化水平促进猪卵巢颗粒细胞中zfp42和/或h3k27ac的表达。

7、所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa的使用浓度优选为0.5μmol/l。

8、所述的促进猪卵巢颗粒细胞中zfp42和/或h3k27ac的表达包括促进zfp42基因和蛋白的表达，以及促进h3k27ac蛋白的表达。

9、所述的抑制hdac2的表达的试剂为小干扰片段，其序列如下：

10、sihdac2：5′-gaagttaaaccgacaacaa-3′(seq id no.2)。

11、所述的抑制hdac2的表达的试剂的使用浓度优选为50nmol/l。

12、所述的抑制hdac2的表达的试剂通过干扰hdac2表达(下调hdac2表达量)促进zfp42启动子-1574/-1829bp区域(p4区域)的染色质开放程度，即zfp42启动子-1574/-1829bp区域(p4区域)受hdac2调控，且h3k27ac富集在zfp42启动子-1574/-1829bp区域(p4区域)；其中，

13、用于扩增zfp42基因启动子-1574/-1829bp区域(p4区域)的引物序列如下：

14、p4-f：5′-tggtcacttggtttgtgttgg-3′(seq id no.16)；

15、p4-r：5′-accaccctctttgcatcagt-3′(seq id no.17)。

16、所述的zfp42启动子-1574/-1829bp区域的h3k27ac乙酰化水平调控zfp42的转录和翻译。

17、所述的提高zfp42启动子-1574/-1829bp区域(p4区域)上h3k27ac乙酰化水平通过将pcdna-dcas9-p300 core(简称dcas9-p300)和grna(p4)共转染至猪卵巢颗粒细胞的方式实现；其中，grna(p4)的序列如下：5′-tgtcatatgaacccagctcaagg-3′(seq id no.18)；dcas9-p300靶向p4区域后，zfp42与h3k27ac的表达量增加。

18、本发明的验证过程如下：

19、(1)分别使用0.5μm的tsa和dmso处理猪卵巢颗粒细胞，24h后收集细胞，提取rna和蛋白。检测zfp42(ncbi登录号：100627512)，hdac1(ncbi登录号：100622482)，hdac2(ncbi登录号：100156170)，hdac3(ncbi登录号：100511372)基因的rna和蛋白的表达。检查h3k27ac蛋白的表达。

20、(2)合成hdac1，hdac2，hdac3的干扰rna(sihdac1、sihdac2、sihdac3)。分别将50nmol/l的干扰rna转染至猪卵巢颗粒细胞，24h后收集细胞，提取rna和蛋白，检测zfp42和h3k27ac的表达。

21、(3)将sihdac2转染至细胞，24h后收集细胞使用染色质可及性实验方法，探究zfp42启动子四个区域的开放程度。

22、(4)使用chip实验方法，检测zfp42启动子四个区域对h3k27ac抗体的富集程度。

23、(5)将dcas9-p300和grna(p4)共转染至颗粒细胞，将zfp42的超表达载体和干扰片段分别转染至猪卵巢颗粒细胞，24h后收集细胞。一部分细胞提取rna和蛋白，检测zfp42和h3k27ac的表达；另外一部分细胞使用chip实验方法，排除grna的脱靶效应。

24、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

25、1、本发明采用细胞生物学方法研究组蛋白乙酰化对zfp42转录调控的影响，组蛋白乙酰化上调zfp42的表达，并进一步筛选出是hdac2介导了组蛋白乙酰化调控zfp42表达的过程；然后通过染色质可及性和chip实验，发现hdac2介导zfp42启动子的p4(-1574/-1829bp)区域的h3k27ac乙酰化水平，从而调控zfp42基因的转录和翻译，即本发明首次表明zfp42受h3k27ac调控，并进一步确定了zfp42启动子区域的受乙酰化调控的区域。

26、2、本发明使用rna干扰技术，合成了hdac1、hdac2、hdac3的干扰片段(sihdac1，sihdac2，sihdac3)，结果发现只有sihdac2促进zfp42基因的表达，且干扰hdac2表达后，zfp42基因启动子区域的p4(-1574/-1829bp)更开放。

27、3、本发明从多层次、多角度验证，在转录水平以及翻译水平进行验证，设计周详，结果可靠。