一种平铺光片显微镜、其成像方法、显微镜系统和检测相机与流程

本公开涉及一种精密光学仪器、其使用方法和包括该精密光学仪器的系统，特别是涉及一种平铺光片显微镜、其成像方法和相应的显微镜系统。

背景技术：

1、选择性平面照明显微镜(spim)(即光片显微镜(lsm))的3d成像能力取决于激发光片的光强分布。激发光片的厚度、光约束能力和尺寸分别决定了轴向分辨率、光学切片能力和视野(fov)的大小。因此，为了在lsm中在大fov上实现高的3d成像能力，需要约束照明光，使之同时尽可能地靠近成像平面并且尽可能远地沿光传播方向延伸。

2、尽管花费了精力来优化lsm中的激发光片的光强分布，但光的衍射使得无法同时减小光片厚度、提高光约束能力和增加光片尺寸。因此，开发了除优化光片光强分布以外的方法来解决该问题。一种有效的策略是，在成像平面内沿光传播方向快速平铺(移动)激发光片，以便在远大于光片本身尺寸的fov中实现高的空间分辨率和良好的光学切片能力。平铺光片显微镜(tlsm)使用这种策略以提高lsm对大样本进行成像的3d成像能力。

3、在tlsm中，通过在成像平面内的多个位置平铺短而薄的光片并在各个平铺位置拍摄图像来对大的成像平面进行成像。使用在所有平铺位置采集到的原始图像重建最终图像。已经证明，tlsm在对大样本(从活胚胎标本到光学透明化的生物组织)进行成像方面比传统lsm具有好得多的3d成像能力。此外，tlsm允许调整激发光片的光强分布和平铺位置，并轻松校正激发光片对准误差，从而可以基于样本和各种应用中的成像需求实时优化tlsm的3d成像能力。尽管tlsm具有先进的3d成像能力，但tlsm所需的额外相机曝光会导致问题。成像速度降低，原始数据大小与平铺数量(即，每个图像平面所需的相机曝光次数)成比例地增加。因此，使用tlsm的大样本3d成像时，无法同时满足对高3d成像能力和高成像通量的需求。

4、在我们之前的研究中，我们开发了一种使用不连续光片来提高tlsm的成像效率而且不牺牲其3d成像能力的方法。在该方法中，通过使用与由检测相机的卷帘快门控制的虚拟共焦狭缝同步的同轴光束阵列扫描来创建不连续光片，并使用不连续光片对成像平面进行照明，参见“d.wang,y.jin,r.feng,y.chen,l.gao,"tiling light sheet selectiveplane illumination microscopy using discontinuous light sheets",opt express.,27(23),34472-34483(2019)”。实验证实，使用不连续光片通过在各个平铺位置对成像平面的更加有效的区域进行成像，在不影响空间分辨率和光学切片能力的前提下，提高了成像效率并减小了tlsm的原始数据大小。

5、然而，光学校准对于在tlsm中使用通过扫描同轴光束阵列生成的不连续光片进行样本照明非常关键，因为必须始终保证同轴光束阵列扫描与由检测相机控制的全局(单个)虚拟共焦狭缝(其只有几微米宽)同步，如图1所示。在使用不连续光片对大型透明化生物组织进行成像的应用中，我们发现出于多个原因而难以满足同步需求。首先，同步对显微镜的校准误差非常敏感。任何校准误差都可能破坏同步。其次，样本并不总是完全透明或均匀的。由样本引入的光学像差也会妨碍同步并降低成像质量。最后，当期望高空间分辨率时，这尤其具有挑战性，这经常需要同轴光束阵列扫描与仅几微米宽(对应于检测相机上的几个像素行)的狭窄的虚拟共焦狭缝的同步。特别地，扫描同轴光束阵列必须与虚拟共焦狭缝同步，而虚拟共焦狭缝足够狭窄以阻挡由同轴光束阵列产生的离焦荧光背景，其中虚拟共焦狭缝由scmos检测相机的卷帘快门控制。

6、本公开是为了解决上述背景技术中的缺陷而提供的。

技术实现思路

1、因此，需要一种平铺光片显微镜、其成像方法及相应的显微镜系统，其既能提高tlsm的成像效率，又能放宽tlsm中使用不连续光片的同步要求。

2、根据本公开的第一方案，提供了一种tlsm。该tlsm包括用于对激发激光束进行相位调制的空间光调制器(slm)、振镜、激发物镜和检测相机。slm的光学调制平面与激发物镜的后瞳共轭。slm被配置为：加载组合相位图，以将对应的相位图加载到激发物镜的后瞳的各组光瞳分部，来创建非同轴激发光束阵列，其中的激发光束沿激发光传播方向和光束阵列扫描方向分开。后瞳包括多组光瞳分部，激发光束分别由不同组的光瞳分部产生。检测相机被配置为通过扫掠多个区域虚拟共焦狭缝来进行曝光。振镜被配置为与区域虚拟共焦狭缝的扫掠同步地扫描非同轴激发光束阵列。各个激发光束的扫描与一个相对应的区域虚拟共焦狭缝的扫掠同步，以便产生不连续光片用于成像平面的照明。

3、根据本公开的第二方案，提供了一种tlsm的成像方法。该tlsm包括用于对激发激光束进行相位调制的空间光调制器(slm)、振镜、激发物镜和检测相机。slm的光学调制平面与激发物镜的后瞳共轭。该成像方法包括如下的步骤。向slm加载组合相位图，以将对应的相位图加载应用到激发物镜的后瞳的各组光瞳分部，以创建非同轴激发光束阵列，其中，各个激发光束沿激发光传播方向和光束阵列扫描方向分开。后瞳包括多组光瞳分部，激发光束分别由不同组的光瞳分部产生。通过扫掠多个区域虚拟共焦狭缝来进行曝光，并且非同轴激发光束阵列的扫描与多个区域虚拟共焦狭缝的扫掠分别同步，以便产生不连续光片以对成像平面进行成像。

4、根据本公开的第三方案，提供了一种tlsm系统。该系统可以包括根据本公开的任一实施例的tlsm和至少一个处理器。该至少一个处理器被配置为通过计算以相应的振幅掩膜(amplitude mask)加权的要加载到多组光瞳分部的相位图的总和来模拟组合相位图。

5、根据本公开的第四方案，提供了一种检测相机。该检测相机包括相机传感器、至少一个卷帘快门和至少一个控制器，该至少一个控制器被配置为控制该至少一个卷帘快门以进行多个区域虚拟共焦狭缝的扫掠，该多个区域虚拟共焦狭缝能够沿着区域虚拟共焦狭缝的扫掠方向相互分离。

6、通过该平铺光片显微镜、其成像方法、对应的显微镜系统及检测相机，本发明既能够提高tlsm的成像效率，又可以放宽tlsm中对使用不连续光片的同步要求。

技术特征：

1.一种平铺光片显微镜，包括用于对激发激光束进行相位调制的空间光调制器(slm)、振镜、激发物镜和检测相机，所述slm的光学调制平面与所述激发物镜的后瞳共轭，其特征在于，

2.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述振镜进一步被配置为：扫描所述非同轴激发光束阵列，使得所述非同轴激发光束阵列内各个激发光束的扫描与由所述检测相机控制的相应虚拟共焦狭缝的扫掠时间同步。

3.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，各个区域虚拟共焦狭缝在所述扫描方向上的宽度能够大至所述非同轴激发光束阵列的间隙距离的1.5倍。

4.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述多个区域虚拟共焦狭缝的几何形状与所述非同轴激发光束阵列的光强分布相匹配。

5.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述多个区域虚拟共焦狭缝沿所述扫描方向相互分离，所述检测相机包括单个scmos相机，所述scmos相机具有多个卷帘快门以控制不同像素行在不同区域内的曝光，从而获得所述多个区域虚拟共焦狭缝。

6.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述多个区域虚拟共焦狭缝沿所述扫描方向相互分离，所述检测相机包括多个scmos相机单元，各个所述scmos相机单元都配备有卷帘快门并协作控制不同像素行在不同区域内的曝光，从而获得所述多个区域虚拟共焦狭缝。

7.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述检测相机是配备有单个卷帘快门的scmos相机，所述卷帘快门的扫掠方向相对于所述非同轴激发光束阵列的所述扫描方向形成非零失配角，从而获得倾斜的全局虚拟共焦狭缝，其中的不同区域用作所述多个区域虚拟共焦狭缝。

8.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，各个激发光束的尾部在光传播方向上不与相邻的激发光束的腰部重叠。

9.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述slm进一步被配置为加载叠加了球面相位的组合相位图，以便在需要平铺以对整个成像平面进行成像的情况下对所述不连续光片进行平铺。

10.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，在各个激发光束在光传播方向上与相邻的激发光束邻接并且不需要对所述不连续光片进行平铺的情况下，所述slm是连续相位slm。

11.根据权利要求5或6所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述检测相机进一步被配置为控制所述卷帘快门，以根据扫描速度和沿扫描方向的相邻激发光束之间的间隙距离来调整各个区域虚拟共焦狭缝的宽度、曝光开始、曝光终止和移位速度中的至少一个，从而使所述多个区域虚拟共焦狭缝的扫掠与所述非同轴激发光束阵列的扫描同步。

12.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，对于所述后瞳的各组光瞳分部，所述光瞳分部是在圆周方向上以第一移位角间隔均匀分布的径向分部，各组光瞳分部作为整体在圆周方向上与相邻的一组光瞳分部偏离第二移位角间隔。

13.根据权利要求12所述的平铺光片显微镜，其特征在于，各个径向分部的弧度角为360°/(m×n)，m为总组数，n为各组中的径向分部数，第一移位角间隔为360°/n，第二移位角间隔为360°/(m×n)。

14.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，所述光瞳分部均匀分布并分配到不同的分部组。

15.根据权利要求12所述的平铺光片显微镜，其特征在于，以相应的振幅掩膜加权后的要加载到多组光瞳分部的相位图的总和被计算为所述组合相位图。

16.根据权利要求1所述的平铺光片显微镜，其特征在于，进一步包括处理器，所述处理器被配置为修改所述组合相位图以调整所述非同轴激发光束阵列的下列属性中的至少一个：

17.一种平铺光片显微镜的成像方法，所述平铺光片显微镜包括用于对激发激光束进行相位调制的空间光调制器(slm)、振镜、激发物镜和检测相机，所述slm的光学调制平面与所述激发物镜的后瞳共轭，所述成像方法包括：

18.根据权利要求17所述的成像方法，其特征在于，扫描所述非同轴激发光束阵列进一步包括：与相应的区域虚拟共焦狭缝的扫掠时间同步地扫描所述非同轴激发光束阵列内的各个激发光束。

19.根据权利要求17所述的成像方法，其特征在于，扫掠多个区域虚拟共焦狭缝进一步包括：将各个区域虚拟共焦狭缝在所述扫描方向上的宽度限定为所述非同轴激发光束阵列的间隙距离的最多1.5倍。

20.根据权利要求17所述的成像方法，其特征在于，扫掠多个区域虚拟共焦狭缝进一步包括：将所述多个区域虚拟共焦狭缝的几何形状与所述非同轴激发光束阵列的光强分布相匹配。

21.根据权利要求17所述的成像方法，其特征在于，所述多个区域虚拟共焦狭缝沿所述扫描方向相互分离，扫掠多个区域虚拟共焦狭缝进一步包括以下的至少一项：

22.根据权利要求21所述的成像方法，其特征在于，扫掠多个区域虚拟共焦狭缝进一步包括：控制卷帘快门，以根据扫描速度和沿所述扫描方向的相邻激发光束之间的间隙距离，来调整各个区域虚拟共焦狭缝的宽度、曝光开始、曝光终止和移位速度中的至少一个，以便使所述多个区域虚拟共焦狭缝的扫掠与所述非同轴激发光束阵列的扫描同步。

23.一种平铺光片显微镜系统，包括：

24.一种检测相机，包括相机传感器、至少一个卷帘快门和至少一个控制器，所述至少一个控制器被配置为控制所述至少一个卷帘快门以进行多个区域虚拟共焦狭缝的扫掠，所述多个区域虚拟共焦狭缝能够沿所述多个区域虚拟共焦狭缝的扫掠方向相互分离。

25.根据权利要求24所述的检测相机，其特征在于，所述检测相机包括具有多个卷帘快门和一个控制器的单个scmos相机，所述控制器进一步被配置为控制多个卷帘快门，以进行在所述相机传感器的不同区域中对不同像素行的曝光，从而获得所述多个区域虚拟共焦狭缝。

26.根据权利要求24所述的检测相机，其特征在于，所述检测相机包括多个scmos相机单元以及至少一个控制器，多个scmos相机单元中的每一个都配备单个的卷帘快门，所述至少一个控制器被配置为控制各个scmos相机单元的各个卷帘快门以进行在所述相机传感器的不同区域中对不同像素行的曝光，从而获得所述多个区域虚拟共焦狭缝。

27.根据权利要求24所述的检测相机，其特征在于，所述检测相机包括配备有单个卷帘快门和单个控制器的scmos相机，所述单个控制器被配置为控制所述单个卷帘快门，以使扫掠方向相对于光束阵列扫描方向形成非零失配角，从而获得倾斜的全局虚拟共焦狭缝，其中的不同区域用作所述多个区域虚拟共焦狭缝。

28.根据权利要求24-27中任一项所述的检测相机，其特征在于，所述检测相机被用于根据权利要求1-16中任一项所述的平铺光片显微镜，且所述多个区域虚拟共焦狭缝沿光束阵列扫描方向相互分离。

29.根据权利要求28所述的检测相机，其特征在于，所述至少一个控制器进一步被配置为使相应的虚拟共焦狭缝的扫掠时间与所述非同轴激发光束阵列内的各个激发光束的扫描时间同步。

30.根据权利要求28所述的检测相机，其特征在于，所述至少一个控制器被进一步配置为控制卷帘快门，以根据扫描速度和沿所述扫描方向的相邻激发光束之间的间隙距离，来调整各个区域虚拟共焦狭缝的宽度、曝光开始、曝光终止和移位速度中的至少一个，以便使所述多个区域虚拟共焦狭缝的扫掠与所述非同轴激发光束阵列的扫描同步。

31.根据权利要求25或26所述的检测相机，其特征在于，不同区域包括不同像素列。

技术总结本申请涉及一种平铺光片显微镜(TLSM)、其成像方法和相应的显微镜系统。该TLSM包括用于对激发激光束进行相位调制的SLM、振镜、激发物镜和检测相机。SLM被配置为：加载组合相位图，以将相应的相位图应用于激发物镜的后瞳的各组光瞳分部，从而创建非同轴激发光束阵列，激发光束沿扫描方向分开。振镜被配置为与由检测相机控制的多个区域虚拟共焦狭缝的扫掠同步地扫描非同轴激发光束阵列，从而产生不连续光片用于对成像平面进行照明。它既能提高TLSM的成像效率，又能放宽TLSM中使用不连续光片的同步要求。技术研发人员：高亮受保护的技术使用者：锘海生物科学仪器（上海）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/1