Cu2O纳米酶的合成方法及其传感器的构建与在检测DON毒素上的应用

本发明涉及玉米don毒素检测，具体涉及cu2o纳米酶的合成方法及其传感器的构建与在检测don毒素上的应用。

背景技术：

1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)，又称呕吐毒素，是谷物(如小麦、玉米、燕麦等)和谷类产品(如面包、面条、啤酒等)中最常见的b族单端孢霉烯类毒素之一。在食物中，don通常以低浓度存在，即使少量食用，也会对人体造成致畸、致癌等不可逆的健康损害。因此，从生产前端到食用末端，需要采取适当的质量控制和储存条件，以控制真菌毒素的污染，建立一种简便快捷的检测方案，以有效监控真菌毒素污染问题。

2、迄今为止，已经发展出各种检测食品和饲料中don的分析方法及组合技术，如高效液相色谱(hplc)、高效液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)、表面增强拉曼光谱(sers)、免疫层析、色谱-质谱联用(gc-ms)和酶联免疫吸附试验(elisa)。然而，hplc、hplc-ms/ms、sers和gc-ms往往存在一定的局限性，限制其广泛应用。

3、hplc能高灵敏、高选择性进行定性定量测定和广泛的适用性，这也导致了其样品前处理较为繁琐、仪器昂贵和成本较高。与hplc相比，hplc-ms/ms具有分辨率高，自动化和微量进样，有非常明显的优势，但对操作人员要求较高，设备比较昂贵。gc/ms具有灵敏、精确，可用于同一样品中的多种真菌毒素的同时检测等优势，但其分析前需要对样品进行提取、净化和浓缩、需要熟练的操作人员，不适合作为一般的实验室检测。这些预处理过程复杂、耗时、昂贵等局限性阻碍了在实际中的广泛应用。酶联免疫吸附试验中酶容易受反应条件和环境容易影响，样品要保存在低温环境中，并且其稳定性、重复性、精确性差等问题使其应用受到限制。因此，开发一种可靠、灵敏、快速的检测手段对食品中don的残留监测具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种cu2o纳米酶的合成方法及其传感器的构建与在检测don毒素上的应用。本发明以聚乙烯吡罗烷酮(pvp)作为一种结构导向剂，合成过程中pvp吸附在晶体表面，阻止其表面生长，合成具有不同晶面的cu2o。再利用cu2o作为载体，构建用于食品领域中真菌毒素don的检测。构建过程中无需复杂的交联剂活化，抗体通过静电吸附吸附在cu2o的表面，构建抗原包被的捕获平台，探针具有优异的稳定性和特异性，在don毒素的快速检测中表现出优异的性能，可作为一种高效快速检测手段。

2、为解决现有技术不足，本发明采取的技术方案为：

3、cu2o纳米酶的合成方法，包括以下步骤：

4、步骤1，取0.171g cucl2·2h2o溶于去离子水中超声分散，加入0-5.55g mw为40000的结构导向剂pvp搅拌均匀得混合溶液；

5、步骤2，将混合溶液转入水浴锅中于40-60℃下进行水热反应，600rpm下搅拌均匀，搅拌的同时加入10ml 2m的naoh反应30min；

6、步骤3，再加入10ml 0.6m抗坏血酸，将转速提高至1000～1500rpm，继续反应3h，离心后取沉淀，并依次用去离子水与乙醇分别清洗3次，再于40-60℃下烘干，得到不同形貌的cu2o纳米酶。

7、作为改进的是，当pvp的用量为0时，所得纳米酶的形貌为立方体；当pvp的用量为3.33g时，所得纳米酶的形貌为截角八面体，当pvp的用量为5.55g时，所得纳米酶的形貌为八面体。

8、作为改进的是，步骤2中水热反应温度为55℃。

9、作为改进的是，步骤3中转速为1200rpm，烘干温度在55℃。

10、上述合成方法合成得到的cu2o纳米酶在制备传感器上的应用，包括以下步骤：

11、第一步，探针的构建

12、取cu2o纳米酶溶于去离子水得1mg/ml的原液；将don单克隆抗体配制为50μg/mldon单克隆抗体溶液；再将1mg/ml的原液与don单克隆抗体溶液按体积比为2:1进行混合，常温下震荡混匀3h，随后加入质量分数为10％的bsa溶液200μl，常温下阻滞30min，离心弃去上清液，取沉淀溶于6ml去离子水中得探针，并于4℃下保存备用；

13、第二步，抗原包被

14、以96孔板为载体，将don抗原稀释至25μg/ml，再与ph＝9.6，0.05m的碳酸盐缓冲液等体积混匀，取100μl混合溶液加入96孔板中，在37℃孵育4h后，在每个孔中加入1％的ova-pbst封闭液150μl，于37℃下阻滞30min，之后用pbst缓冲液洗涤数次并干燥，即得基于cu2o纳米酶的传感器。

15、作为改进的是，第一步中，离心的转速为10000rpm，时长为10min。

16、上述基于cu2o纳米酶的传感器在检测食品中don毒素上的应用。

17、作为优选的是，所述应用的具体步骤为：取包被过后的96孔板，每个孔中依次加入50μldon标准品、50μl探针，于37℃下孵育30min，再用pbst缓冲液洗涤数次，除去未结合的纳米探针，最后加入150μlph＝6，0.2m naac-hac缓冲液、60μl 120mm h2o2和40μl 30mmtmb，室温下反应10min，随后，记录反应体系的颜色变化和紫外-可见吸收光谱。

18、有益效果：

19、与现有技术相比，本发明cu2o纳米酶的合成方法及其传感器的构建与在检测don毒素上的应用。本发明通过改变表面活性剂(pvp)的用量，合成了不同形貌的cu2o，通过对tmb的显色证实了均具有过氧化物酶活性，并进行了酶促动力学测定。基于立方体cu2o新型纳米材料对tmb快速响应的信号这一特点，建立新型传感器，并应用don毒素的检测，相比传统检测手段，大幅度缩短检测时间，具有良好的适用性、稳定性，良好的可行性与特异性。本发明所构建的新型传感器具有优异的特异性、稳定性和可重复性，为真菌毒素的快速检测提供一种新思路，在食品安全检测方面具有潜在的应用价值。具体优势如下：

20、1.本发明选用pvp作为一种结构导向剂，在合成过程中，pvp可以附着晶体表面，阻止表面的进一步生长，进而合成不同晶面的cu2o。通过调节pvp的用量合成不同的cu2o，以tmb作为显色底物确定其均具有过氧化物酶特性，具有大比表面积的立方体体现出最高的酶活性。

21、2.本发明合成的cu2o再制备探针时，不需要多余的交联剂活化，可直接与抗体交联，构建cu2o-ab1探针。

22、3.本发明构建的cu2o纳米酶探针在检测过程中随着don浓度的增加，比色信号越低，颜色越浅，检测信号与靶标浓度成一定的线性关系，可通过肉眼直接分辨的同时也能够定量检测don,实现快速检测。

23、4.本发明制备的新型传感器具有良好的环境适用性以及生物相容性，在检测过程中有很好的抗干扰能力，且以九六孔板为载体可以说同时实现多个样本的检测，大大缩短检测时间。并且检测过程中并不需要考虑天然酶因恶劣环境失活的问题，具有很好的适用性的同时可以实现检测的便捷，还能大幅度降低检测的成本。