一种高温下高效催化合成塔格糖酶及其应用的制作方法

本发明涉及塔格糖的生物发酵方法，具体涉及一种高温下高效催化合成塔格糖酶及其应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、据发明人研究了解，通过糖原磷酸化酶、葡糖磷酸变位酶、葡萄糖六磷酸异构酶、塔格糖六磷酸合成酶、磷酸酶的共同作用将淀粉一步转化形成塔格糖，其具体过程为：淀粉与磷酸在糖原磷酸化酶的催化作用下形成萄糖-1-磷酸(葡萄糖一磷酸)，通过葡糖磷酸变位酶可将葡萄糖一磷酸变构形成葡萄糖-6-磷酸(葡萄糖六磷酸)，在葡萄糖六磷酸异构酶的催化作用下可以将葡萄糖六磷酸异构形成果糖-6-磷酸(果糖六磷酸)，果糖六磷酸经过塔格糖六磷酸合成酶的催化异构形成塔格糖-6-磷酸(塔格糖六磷酸)，塔格糖六磷酸在磷酸酶的作用下脱磷形成塔格糖。然而，目前采用上述方法将淀粉一步转化形成塔格糖的副产物较多，产率较低，从而影响其在生产塔格糖中的应用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高温下高效催化合成塔格糖酶及其应用，本发明提供的塔格糖酶具有更高的温度稳定性，更有利于提高淀粉转化为塔格糖的效率。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、第一方面，一种高温下高效催化合成塔格糖酶，包括塔格糖六磷酸合成酶和塔格糖六磷酸磷酸酶，所述塔格糖六磷酸合成酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述塔格糖六磷酸磷酸酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。

4、本发明研究发现，塔格糖六磷酸合成酶的催化效率较低以及对果糖六磷酸底物的亲和度较高，导致淀粉转化形成塔格糖六磷酸效率低；同时，磷酸酶在脱磷酸过程中塔格糖六磷酸的特意选择性较差，导致反应体系中会有大量的葡萄糖一磷酸、葡萄糖六磷酸以及果糖六磷酸被脱磷最终产生较多的葡萄糖与果糖为副产物；因此，影响淀粉一步法制备塔格糖的产率。

5、因此，本发明首先从高温热泉的宏基因组中筛选并克隆出了一个来源于thermoflexus sp.的塔格糖六磷酸合成酶(t6pe-t)，相比现有的塔格糖六磷酸合成酶，t6pe-t具有更高高温催化稳定性以及极低的果糖六磷酸km，能够在在添加更少的酶的条件下通过高温(50～70℃)持续更专一地催化产生更多的塔格糖六磷酸；其次，本发明从高温热泉宏基因组中筛选并克隆出了一个来源于thermoanaerobacterales bacterium的塔格糖六磷酸磷酸酶，与现有塔格糖六磷酸磷酸酶相比，本发明提供的塔格糖六磷酸磷酸酶可以在更高的温度(70℃)条件下能够高选择性地将塔格糖六磷酸脱磷形成，极大程度上降低葡萄糖和果糖等副产物的生成，从而提高塔格糖的产率。

6、第二方面，一种核酸分子，包括编码塔格糖六磷酸合成酶的核苷酸和编码塔格糖六磷酸磷酸酶的核苷酸，所述塔格糖六磷酸合成酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述塔格糖六磷酸磷酸酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。

7、进一步地，编码塔格糖六磷酸合成酶的核苷酸的核酸序列如seq id no.2所示。

8、进一步地，编码塔格糖六磷酸磷酸酶的核苷酸的核酸序列如seq id no.6所示。

9、第三方面，一种微生物，能够表达塔格糖六磷酸合成酶和塔格糖六磷酸磷酸酶，所述塔格糖六磷酸合成酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述塔格糖六磷酸磷酸酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。

10、本发明所述的微生物可以为一组分别能够表达塔格糖六磷酸合成酶和塔格糖六磷酸磷酸酶的工程菌组，也可以为一株能够同时能够表达塔格糖六磷酸合成酶和塔格糖六磷酸磷酸酶的工程菌。

11、进一步地，所述微生物的出发菌株为大肠杆菌。具体为大肠杆菌bl21。

12、更进一步地，能够表达塔格糖六磷酸合成酶的工程菌的构建方法为：将第一引物对编码塔格糖六磷酸合成酶的核苷酸的核酸序列进行扩增，将扩增产物与载体制成重组载体，将重组载体转入至出发菌中；所述第一引物对的碱基序列分别如seq id no.3和seq idno.4所示。具体地，所述载体为pet41载体。

13、进一步地，能够表达塔格糖六磷酸磷酸酶的工程菌的构建方法为：将第二引物对编码塔格糖六磷酸磷酸酶的核苷酸的核酸序列进行扩增，将扩增产物与载体制成重组载体，将重组载体转入至出发菌中；所述第二引物对的碱基序列分别如seq id no.7和seq idno.8所示。具体地，所述载体为pet41载体。

14、第四方面，一种上述高温下高效催化合成塔格糖酶、核酸分子或微生物在淀粉一步制备塔格糖中的应用。

15、进一步地，将所述高温下高效催化合成塔格糖酶、核酸分子或微生物，以及淀粉磷酸化酶、葡萄糖6磷酸异构酶、果糖六磷酸异构酶加入至含有淀粉的反应体系中，加热至65～70℃进行催化反应60～84h。

16、更进一步地，反应体系中淀粉的起始浓度为250～350g/l。

17、更进一步地，反应体系中含有磷酸氢二钾和硫酸镁。具体地，磷酸氢二钾和硫酸镁的摩尔比为9～11:1。具体地，反应体系中含有磷酸氢二钾的浓度为45～55mm。本发明中单位“m”是指mol/l，单位“mm”是指mmol/l。具体地，反应体系中的ph为6.9～7.2。

18、第五方面，一种产品1在催化果糖六磷酸制备塔格糖六磷酸或催化淀粉一步制备塔格糖中的应用，所述产品1为塔格糖六磷酸合成酶、编码所述塔格糖六磷酸合成酶的核苷酸或表达所述塔格糖六磷酸合成酶的微生物，所述塔格糖六磷酸合成酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

19、本发明从高温热泉的宏基因组中筛选并克隆出了一个来源于thermoflexus sp.的塔格糖六磷酸合成酶(t6pe-t)，相比现有的塔格糖六磷酸合成酶，t6pe-t具有更高高温催化稳定性以及极低的果糖六磷酸km，能够在在添加更少的酶的条件下通过高温(50～70℃)持续更专一地催化产生更多的塔格糖六磷酸，从而提高塔格糖六磷酸的收率。

20、进一步地，编码塔格糖六磷酸合成酶的核苷酸的核酸序列如seq id no.2所示。

21、进一步地，所述微生物的出发菌株为大肠杆菌。具体为大肠杆菌bl21。

22、更进一步地，能够表达塔格糖六磷酸合成酶的微生物的构建方法为：将第一引物对编码塔格糖六磷酸合成酶的核苷酸的核酸序列进行扩增，将扩增产物与载体制成重组载体，将重组载体转入至出发菌中；所述第一引物对的碱基序列分别如seq id no.3和seq idno.4所示。具体地，所述载体为pet41载体。

23、进一步地，催化果糖六磷酸制备塔格糖六磷酸中，向含有果糖六磷酸的反应液中添加产品1，在65～70℃的条件下进行催化反应。

24、更进一步地，所述反应液中果糖六磷酸的浓度为40～60mm。

25、更进一步地，所述反应液中含有磷酸二氢钾和硫酸镁。具体地，磷酸氢二钾和硫酸镁的摩尔比为9～11:1。具体地，反应体系中含有磷酸氢二钾的浓度为45～55mm。

26、进一步地，催化淀粉一步制备塔格糖中，向含有淀粉的反应体系中添加所述产品1，以及淀粉磷酸化酶、葡萄糖6磷酸异构酶、果糖六磷酸异构酶和塔格糖六磷酸磷酸酶，加热至65～70℃催化反应60～84h。

27、更进一步地，所述反应液中含有磷酸二氢钾和硫酸镁。具体地，磷酸氢二钾和硫酸镁的摩尔比为9～11:1。具体地，反应体系中含有磷酸氢二钾的浓度为45～55mm。

28、第六方面，一种产品2在催化塔格糖六磷酸脱磷形成塔格糖中的应用，所述产品2为塔格糖六磷酸磷酸酶、编码所述塔格糖六磷酸磷酸酶的核苷酸或表达所述塔格糖六磷酸磷酸酶的微生物，所述塔格糖六磷酸合成酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。

29、本发明本发明从高温热泉宏基因组中筛选并克隆出了一个来源于thermoanaerobacterales bacterium的塔格糖六磷酸磷酸酶，与现有塔格糖六磷酸磷酸酶相比，本发明提供的塔格糖六磷酸磷酸酶可以在更高的温度(70℃)条件下能够高选择性地将塔格糖六磷酸脱磷形成，极大程度上降低葡萄糖和果糖等副产物的生成。

30、进一步地，编码塔格糖六磷酸合成酶的核苷酸的核酸序列如seq id no.6所示。

31、进一步地，所述微生物的出发菌株为大肠杆菌。具体为大肠杆菌bl21。

32、更进一步地，能够表达塔格糖六磷酸磷酸酶的微生物的构建方法为：将第二引物对编码塔格糖六磷酸磷酸酶的核苷酸的核酸序列进行扩增，将扩增产物与载体制成重组载体，将重组载体转入至出发菌中；所述第二引物对的碱基序列分别如seq id no.7和seq idno.8所示。具体地，所述载体为pet41载体。

33、进一步地，向含有塔格糖六磷酸的反应液中添加产品2，在65～70℃的条件下进行催化反应。

34、更进一步地，所述反应液中含有磷酸二氢钾和硫酸镁。具体地，磷酸氢二钾和硫酸镁的摩尔比为9～11:1。具体地，反应体系中含有磷酸氢二钾的浓度为45～55mm。

35、本发明的有益效果为：

36、本发明通过对高温热泉宏基因组分别筛选了新的塔格糖六磷酸合成酶和塔格糖六磷酸磷酸酶，通过该塔格糖六磷酸合成酶能够在50～70℃的高温条件下持续、专一地催化产生更多的塔格糖六磷酸；并在此基础上，通过筛选的新的塔格糖六磷酸磷酸酶可以在70℃下更加高效的选择塔格糖六磷酸为底物进行脱磷，从而大大提高淀粉一步法制备塔格糖的效率。