一种检测传染性支气管炎病毒的引物探针组合及其应用

本发明涉及病毒检测，特别是涉及一种检测传染性支气管炎病毒的引物探针组合及其应用。

背景技术：

1、传染性支气管炎(infectious bronchitis，ib)是由冠状病毒科、冠状病毒属的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，ibv)引起的一种急性、高度接触性传染病。冠状病毒病毒颗粒呈球状。最显著的特征是从病毒粒子表面发出的棒状尖刺突起。这些尖峰是病毒粒子的一个决定性特征，使它们看起来像日冕，因此得名冠状病毒。冠状病毒颗粒的结构蛋白有四种：纤突蛋白(s蛋白)、膜蛋白(m蛋白)、核衣壳蛋白(n蛋白)和小囊膜蛋白(e蛋白)。其中s基因是变异程度最大的基因。n基因相对变异性小，保守性更高。ib是家禽业经济损失的最主要原因之一，影响肉禽和蛋禽的生产性能。因此对ib的快速检测在ib的防治方面有重大意义。

2、目前针对ib的检测方法主要有鉴别诊断、病毒分离、tr-pcr法以及实时荧光定量pcr法等。这些方法结果准确且具有高度特异性等优点。然而，不同的检测方法依旧存在一些缺点。例如，rt-pcr灵敏度较低、检测时间在数小时以上。实时荧光定量rt-qpcr虽然灵敏度较高，但是检测时间同样需要数小时以上。并且这些检测方法需要专门的检测设备、严格的操作环境以及专业的实验人员等。raa技术是重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase aidedamplification)的简称，是一种利用重组酶、单链结合蛋白、dna聚合酶在等温条件下(最佳温度37℃)进行核酸扩增的技术。具体原理为：重组酶、单链结合蛋白、引物形成复合体扫描双链dna，在与引物同源的序列处使双链dna解旋，单链结合蛋白(ssb)防止单链dna复性，在能量和dntp存在的情况下，由dna聚合酶完成链的延伸。不同于上述检测方法的是raa操作简单、高灵敏度、样品制备要求最低、快速扩增、操作温度较低(25～42℃)以及冻干试剂的商业可用性，无需初始变性步骤或使用多个引物而在等温扩增技术中脱颖而出。该方法已在实验室环境之外、偏远地区得到应用。而基于rt-raa检测原理提供一种具有灵敏度高、易于操作等优势的rt-raa检测方法，是解决目前ibv检测方法灵敏度低、成本高、耗时长以及操作复杂等问题的关键。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测传染性支气管炎病毒的引物探针组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该引物探针组合构建的检测方法能高灵敏度、特异性地检测传染性支气管炎病毒。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种检测传染性支气管炎病毒的引物探针组合，所述引物探针组合包括：

4、特异性上游引物，其核苷酸序列为如seq id no：1-3所示的任一条序列；

5、特异性下游引物，其核苷酸序列为如seq id no：4-6所示的任一条序列；

6、探针，其核苷酸序列为如seq id no：7所示的序列；

7、其中，seq id no：7所示序列第32位的t碱基由荧光基团修饰，第34位为核酸类似物，第35位的t碱基由淬灭基团修饰，3’末端连接封闭基团。

8、优选的是，所述引物探针组合包括如seq id no：2所示的特异性上游引物、seq idno：4所示的特异性下游引物以及seq id no：7所示的探针。

9、优选的是，所述荧光基团包括fam，所述淬灭基团包括bhq，所述核酸类似物包括四氢呋喃，所述封闭基团包括c3 spacer亚磷酰胺。

10、本发明还提供一种非诊断目的的检测传染性支气管炎病毒的方法，包括利用所述的引物探针组合扩增待测样品的rna，根据扩增产物的荧光信号的有无判断是否含有所述传染性支气管炎病毒。

11、优选的是，所述扩增的反应体系包括：缓冲液25μl、特异性上游引物和特异性下游引物各2.1μl、探针0.6μl和乙酸镁5μl，ddh2o补充到总体积50μl。

12、优选的是，所述扩增的反应条件为：39℃反应30min。

13、优选的是，当扩增产物有荧光信号时，即判断为所述待测样品中含有所述传染性支气管炎病毒。

14、本发明还提供所述的引物探针组合在制备检测传染性支气管炎病毒的试剂盒中的应用。

15、本发明还提供一种检测传染性支气管炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物探针组合。

16、本发明公开了以下技术效果：

17、本发明设计了检测ibv的引物探针组合，并建立了rt-raa检测方法，该检测方法可以在39℃20min内检测完毕。该方法稳定性好，特异性强，灵敏度与rt-qpcr一致，高于rt-pcr。操作简单快捷，不需要进行反转录，为一步法检测方法，且不需要严格的操作环境以及专业的实验人员即可操作，适用于临床快速检测，可为ibv快速检测提供技术支持。

技术特征：

1.一种检测传染性支气管炎病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：

2.如权利要求1所述的检测传染性支气管炎病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括如seq id no：2所示的特异性上游引物、seq id no：4所示的特异性下游引物以及seq id no：7所示的探针。

3.如权利要求1所述的检测传染性支气管炎病毒的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团包括fam，所述淬灭基团包括bhq，所述核酸类似物包括四氢呋喃，所述封闭基团包括c3 spacer亚磷酰胺。

4.一种非诊断目的的检测传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于，包括利用权利要求1-3任一项所述的引物探针组合扩增待测样品的rna，根据扩增产物的荧光信号的有无判断是否含有所述传染性支气管炎病毒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应体系包括：缓冲液25μl、特异性上游引物和特异性下游引物各2.1μl、探针0.6μl和乙酸镁5μl，ddh2o补充到总体积50μl。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应条件为：39℃反应30min。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，当扩增产物有荧光信号时，即判断为所述待测样品中含有所述传染性支气管炎病毒。

8.如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合在制备检测传染性支气管炎病毒的试剂盒中的应用。

9.一种检测传染性支气管炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的引物探针组合。

技术总结本发明公开了一种检测传染性支气管炎病毒的引物探针组合及其应用，属于病毒检测领域。本发明选取传染性支气管炎病毒保守区域的N基因作为靶基因，设计多对引物和探针的组合，经过筛选优化筛选得到能够特异性扩增传染性支气管炎病毒RNA的引物探针组合，包括：特异性上游引物，其核苷酸序列为如SEQ ID NO：2‑3所示的任一条序列；特异性下游引物，其核苷酸序列为如SEQ ID NO：4‑6所示的任一条序列；探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。本发明还构建了检测传染性支气管炎病毒的方法，该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简便以及成本低等优势，为传染性支气管炎病毒的检测奠定了理论基础。技术研发人员：贾青辉,冯婉莹,张志强,吴同垒,陈光明,张香斋,李佩国,李蕴玉受保护的技术使用者：河北科技师范学院技术研发日：技术公布日：2024/8/16