一种用于评价甘草道地性的微生物标志物组合及应用

本发明属于生物，具体涉及一种用于评价甘草道地性的微生物标志物组合物及应用。

背景技术：

1、道地药材指质量优秀、疗效显著、历史悠久、产地适宜、带有地域特点的药材。中药材受地理环境、磁场等的影响，同种异地出产的药材，在质量上有明显差异。例如人参、地黄、杜仲、当归等药材，其产地不同，药效差异很大。因此，常把某地出产的药材称为“道地药材”，而其他产地出产的则叫“非道地药材”，道地药材是中医药领域衡量药材质量的一项独特判别标准。

2、甘草，别名国老，以根味甘甜而得名，为豆科甘草属多年生草本植物，中国两千多种草药中用量最大的一种传统中药材，具有调和诸药、益气补脾、祛痰止咳、清热解毒等功效，素有“十方九草，无草不成方”之说。甘草是甘肃省“十大陇药”之一，质量好、产量高、疗效佳，被誉为甘肃道地、大宗药材。

3、判断药材的道地性是评价药材品质的关键。目前，常见的用于判断药材道地性的方法有感官经验评价、色谱、质谱等方法，其中，感官经验评价是药材道地性评价的传统方式，具有操作简便，通俗易懂的特点，在中药质量评价中占有重要地位，但存在受鉴定者主观影响强、性状属性客观化表达和质量属性量化困难等局限性。目前，色谱与各种质谱、核磁共振等联用的中药指纹图谱技术，是药材道地性评价的常用检测手段，但该方法仍具有成本高昂、毒性大、操作复杂、检测速度慢等缺陷。因此，我们需要建立一种更加高效、快速、准确且安全的方法对甘草的道地性进行评估。

4、“微生物组”一词是指整个栖息环境，包括微生物(细菌，古细菌，较低等和较高等的真核生物和病毒)，其基因组以及周围的环境条件。内生菌是药用植物的内部微生物。内生菌的种类和丰度在不同产地有明显差异，气候、土壤等环境因素会影响内生菌的多样性，从而间接造成甘草活性成分含量的差异，使不同地区甘草药效不同，形成甘草的道地性。但是，本领域尚没有使用内生菌对甘草道地性进行评价的研究。

5、针对上述技术问题，本发明对甘草内生菌进行系统分析，并鉴定具有不同丰度的微生物作为生物标记，结合随机森林模型，得到了一种用于甘草道地性评价的方法，并筛选了特定的甘草微生物作为评价甘草道地性的微生物标志物组合，所述的微生物标志物组合包括x.eu bacterium.coprostanoligenes_group，steroidobacter，cephaliophora，rahnella 1，lactobacillu s，thanatephorus，muribaculaceae和sutterella中的一种或几种，使用上述微生物标志物组合对甘草进行道地性评价，具有灵敏度高和特异性强，能够大大改善常规性状鉴别方法主观性强、准确度低，化学指纹图谱等方法成本高、操作复杂、检测速度慢和化学试剂毒性大等缺陷，可以广泛用于甘草的道地性评价，在药材的生产与质量评价方面具有现实意义和应用价值。

6、参考文献

7、[1]张晨,李娜,钟赣生,等.十八反中甘草物种的本草考证[j].中草药,2021,52(20)6425-30.

8、[2]高晓娟,赵丹,赵建军,等.甘草的本草考证[j].中国实验方剂学杂志,2017,23(02)193-8.

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于评价甘草道地性的微生物标志物组合，所述的微生物标志物组合包括x.eubacterium.coprostanoligenes_group，steroidobacter，cephaliophora，rahnella 1，lactobacillus，thanatephorus，muribaculaceae和sutterella中的一种或几种。

2、优选的，所述的微生物标志物组合由x.eubacterium.coprostanoligenes_group，steroidoba cter，cephaliophora，rahnella 1，lactobacillus，thanatephorus，muribaculaceae和sutterell a组成。

3、本发明的第二目的是提供所述的微生物标志物组合在评价甘草道地性中的应用。

4、本发明的第三目的是提供所述的微生物标志物组合在构建评价甘草道地性的模型中的应用。

5、本发明的第四目的是提供一种用于评价甘草道地性的方法，所述的方法包括：(1)采集甘草样本：按照采集区域分为道地组和非道地组；

6、(2)甘草样本消毒：取步骤(1)得到的样本，洗净，截短，乙醇浸泡，次氯酸钠浸泡消毒，吸干水分，-80℃保存；

7、(3)甘草样本生物标志物检测：

8、①基因组dna提取；

9、②目的片段pcr扩增：以步骤①提取的基因组dna为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode的特异引物，tks gflex dna polymerase进行pcr；进行两轮pcr扩增，电泳检测，磁珠纯化；

10、③文库构建和测序：取纯化过的pcr产物进行qubit定量，调整浓度，使用illuminanovas eq 6000测序平台进行测序，并生成250bp双端reads；

11、④生物信息学分析：数据下机后，首先使用cutadapt软件，将rawdata序列剪切掉引物序列，然后，使用dada2，将上一步合格的双端rawdata进行质量过滤，降噪，拼接及去嵌合体等质控分析，得到代表序列及asv丰度表格；使用qiime 2软件包挑选出各个asv的代表序列后，并将所有16s代表序列与silva(version138)数据库进行比对注释，所有its代表序列与unite数据库进行比对注释；

12、(4)构建评价模型：选取步骤(3)测序分析得到的在分组中相对丰度排名前30的细菌属和前30的真菌属构建随机森林模型，随机森林用于识别微生物的重要性特征，根据微生物选择程序对结果预测的影响实施微生物标志物筛选，围绕其默认值进行优化，构建评价模型；

13、(5)模型验证：按照7:3设置内部测试集和验证集来验证筛选出的微生物标志物的可靠性。

14、优选的，步骤①所述的基因组dna提取按照常规方法提取；步骤④所述的质量过滤按照qiime 2(2020.11)默认参数进行，比对注释使用q2-feature-classifier软件默认参数进行分析。

15、优选的，步骤②所述的测序区域包括细菌多样性鉴定对应区域和真菌its多样性鉴定对应区域；所述的细菌多样性鉴定对应区域：16s v3-v4区[引物343f(5’-tacggraggcag cag-3’)和798r(5’-agggtatctaatcct-3’)]，真菌its多样性鉴定对应区域：its[引物its1f(5’-cttggtcatttagaggaagtaa-3’)和its2r(5’-gctgcgttcttcatcgatgc-3’)]；

16、本发明的第五目的是提供通过所述的方法建立的甘草道地性评价模型。

17、本发明的第六目的是提供一种甘草道地性的评价模型系统，包括：

18、(1)预输入模块，至少用于输入待诊断数据；

19、(2)评价模块，至少用于对该待评价数据进行评价，由所述的甘草道地性评价模型执行；

20、(3)显示模块，至少用于显示评价结果。

21、本发明的第七目的是提供一种计算机设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述程序时使所述的系统实现以下步骤，包括：(1)采集和/或输入甘草道地性的评价变量数据；

22、(2)将变量数据代入模型进行计算，得到甘草是否道地性的判断结论；

23、(3)输出甘草是否道地性的判断结论。

24、本发明的第八目的是提供一种计算机可读存储介质，其上存储有所述的计算机设备。

25、本发明的有益效果是：(1)本发明提供一种用于评价甘草道地性的微生物标志物组合，所述的微生物标志物组合包括x.eubacterium.coprostanoligenes_group，steroidobacter，头梗霉属(cephaliophora)，拉恩氏菌属(rahnella 1)，乳杆菌属(lactobacillus)，亡革菌属(tha natephorus)，muribaculaceae和萨特氏菌属(sutterella)中的一种或几种；(2)本发明利用所述的微生物标志物组合建立了一种用于甘草道地性的评价模型，并提供了建立方法，所述的模型能够判断甘草的产地是否是甘草道地产区甘肃，经济实惠、操作简便，适用于中药材市场应用；(3)所述的微生物标志物组合评价甘草道地性时，灵敏度为100.0％，特异性为91.7％，auc为97.22％，具有灵敏度高和特异性强，能够大大改善常规性状鉴别方法主观性强、准确度低，化学指纹图谱方法成本高、操作复杂、检测速度慢和化学试剂毒性大等缺陷，可以广泛用于甘草的道地性评价。