一种检测食源性寄生虫的方法、引物探针组合及试剂盒与流程

本发明属于致病性寄生虫检测，具体涉及一种用于检测食源性寄生虫的方法、引物探针组合及试剂盒。

背景技术：

1、食源性疾病是全球公共卫生领域面临的重大挑战之一，这些疾病通常由摄入被病原体污染的食物或水引起。随着人类饮食来源和方式的多样化，由食源性寄生虫病造成的食品安全问题日益突出。

2、微小隐孢子虫是引起隐孢子虫病的其中一种病原寄生虫，主要寄生在哺乳动物的肠道，尤其流行于反刍动物中。牛、啮齿动物、羊和家养宠物之间可传播微小隐孢子虫，除了动物传播外，微小隐孢子虫还可能通过粪污染传染至人类，其感染的主要途径是饮用含小隐孢子虫卵囊（的水所引起，症状通常于感染后7天左右出现，包括腹痛、水泻、呕吐及发热。

3、卡耶塔环孢子虫是一种重要的食源性传播病原，该病原进入人体后引起以腹泻为主的环孢子虫病，尤其对儿童和免疫缺陷病病人常会造成持续性腹泻。近年来，随着旅游业和食品供应的不断全球化，环孢子虫病传播到非流行地的机会急剧增加，这主要与从流行地进口的新鲜果蔬有关，因此，卡耶塔环孢子虫已对公共卫生安全和食品安全造成了巨大威胁。

4、贝氏囊等孢球虫广泛存在于哺乳类、鸟类和爬行类动物的肠内，感染贝氏囊等孢球虫可引起严重的临床症状，起病急，有发热、持续性或脂肪性腹泻，体重减轻等。世界人体感染贝氏等孢球虫的报告日趋增多，在美国的艾滋病人中，其发病率为15％。人体感染贝氏囊等孢球虫后，因卵囊微小，所以临床常规粪检不易发现，常出现漏诊的情况。

5、由于上述三种寄生虫对人类存在危害，有必要对其采取预防性措施，即通过提前检测防止其引发人体感染，或在人体感染后通过检测实现快速精准治疗。现有技术常用的检测方法包括形态学鉴定、染色法、酶联免疫吸附实验等，但这些方法往往存在检测时间长、操作复杂、灵敏度和特异性有限等不足。荧光定量pcr（quantitative pcr，qpcr）是目前应用最广泛的分子诊断工具之一，该方法通常采用荧光染料对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，不仅检测方法简单，且成本低。

6、本发明通过设计和优化引物探针体系，筛选得到特异性好，灵敏度高的引物探针组合用于检测三种主要食源性寄生虫。此外，本发明优化三重检测体系，在减少操作步骤和所需试剂的同时，提高检测效率和经济性，为食源性疾病的快速诊断和预防提供强有力的工具。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种检测食源性寄生虫的方法；本发明的第二个目的是提供一种用于检测食源性寄生虫的引物探针组合；本发明第三个目的是提供一种用于检测食源性寄生虫的试剂盒；本发明第四个目的是提供所述引物探针组合和试剂盒在制备用于检测食源性寄生虫的产品中的用途。

2、本发明的目的通过如下技术方案实现：

3、第一方面，本发明提供一种检测食源性寄生虫的方法，所述方法包括如下步骤：

4、（1）提取待测样本dna或rna；

5、（2）配置含有引物探针组合的pcr扩增体系进行pcr扩增反应；

6、（3）根据扩增曲线判断待测样本中是否存在相应的食源性寄生虫以及判断食源性寄生虫的初始浓度。

7、本发明所述的食源性寄生虫为微小隐孢子虫（ cryptosporidium parvum）、卡耶塔环孢子虫（ cyclospora cayetanensis）和人源贝氏囊等孢球虫（ cystoisospora belli）的组合。

8、步骤（2）所述的引物探针组合由1）-3）所示的上下游引物和探针组成：

9、1）用于检测微小隐孢子虫的上下游引物如seqidno:1和seqidno:2所示，探针如seqidno:3所示；

10、2）用于检测卡耶塔环孢子虫的上下游引物如seqidno:4和seqidno:5所示，探针如seqidno:6所示；

11、3）用于检测人源贝氏囊等孢球虫的上下游引物如seqidno:7和seqidno:8所示，探针如seqidno:9所示。

12、进一步的，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，且所述探针的荧光报告信号互不干扰；所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。

13、在步骤（2）中所述的扩增体系中，上游引物的终浓度为0.05-0.45µm，下游引物的终浓度为0.05-0.45µm，探针的终浓度为0.05-0.3µm。

14、步骤（2）所述的pcr扩增程序采用50℃ 2分钟，95℃ 3分钟，接40个循环（95℃ 10秒，60℃40秒）的温控程序。

15、本发明所述的待测样本为任何可能含有食源性寄生虫的物质，包括但不限于食品、粪便、口腔拭子、肛拭子。

16、步骤（1）提取待测样本dna或rna可使用市售dna提取试剂盒或本领域技术人员熟知的方法提取，在本发明中不做具体限制。

17、第二方面，本发明提供一种用于检测食源性寄生虫的引物探针组合，所述食源性寄生虫为微小隐孢子虫（ cryptosporidium parvum）、卡耶塔环孢子虫（ cyclospora  cayetanensis）和人源贝氏囊等孢球虫（ cystoisospora belli）的组合，所述引物探针组合由1）-3）所示的上下游引物和探针组成：

18、1）用于检测微小隐孢子虫的上下游引物如seqidno:1和seqidno:2所示，探针如seqidno:3所示；

19、2）用于检测卡耶塔环孢子虫的上下游引物如seqidno:4和seqidno:5所示，探针如seqidno:6所示；

20、3）用于检测人源贝氏囊等孢球虫的上下游引物如seqidno:7和seqidno:8所示，探针如seqidno:9所示。

21、进一步的，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，且所述探针的荧光报告信号互不干扰；所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。

22、本发明所述的“信号互不干扰”是指：上述各探针所用的荧光基团不同，且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用 fam、hex、rox，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，不同通道的信号不会互相干扰；另外，每一种荧光通道的三个信号可以通过加入不同的探针浓度进行荧光值的区分，从而形成不同的聚类信号，并通过聚类分析软件进行进一步的区分，不会相互干扰。

23、在本发明的具体实施方式中，用于检测所述食源性寄生虫的探针5’端标记的荧光报告基团分别选自fam、hex和rox。

24、第三方面，本发明提供一种用于检测食源性寄生虫的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的引物探针组合。

25、所述食源性寄生虫为微小隐孢子虫（ cryptosporidium parvum）、卡耶塔环孢子虫（ cyclospora cayetanensis）和人源贝氏囊等孢球虫（ cystoisospora belli）的组合。

26、进一步的，所述试剂盒还包括酶混合液、阴性质控品、阳性质控品、pcr缓冲液。

27、所述酶混合液中含有高保真taq酶、udg酶、镁离子、dntp中的至少一种。

28、所述阴性质控品为经焦炭酸乙二脂（depc）处理的纯水；阳性质控品为含有本发明所述的食源性寄生虫特定序列的质粒。

29、第四方面，本发明提供一种本发明第二方面提供的引物探针组合和/或本发明第三方面所述的试剂盒在制备用于检测食源性寄生虫产品中的用途。

30、所述食源性寄生虫为微小隐孢子虫（ cryptosporidium parvum）、卡耶塔环孢子虫（ cyclospora cayetanensis）和人源贝氏囊等孢球虫（ cystoisospora belli）的组合。

31、现有技术中没有关于同时检测微小隐孢子虫（ cryptosporidium parvum）、卡耶塔环孢子虫（ cyclospora cayetanensis）和人源贝氏囊等孢球虫（ cystoisospora belli）的报道，且现有的关于食源性寄生虫的检测方法多为定性检测，定性检测灵敏度较低，容易出现假阴性结果，具有一定的局限性。本发明提供的检测方法基于实时荧光定量pcr技术，通过检测荧光信号的强弱从而实时检测pcr产物扩增量，可以进行定量分析，并且检测灵敏度高。

32、此外，本发明对设计得到的引物对进行筛选和优化，选择特异性好，灵敏度高的引物对作为候选，在多重pcr体系中剔除形成引物二聚体的引物对，最终优选得到特异性强、扩增效果好的引物对，将所述引物对进行组合得到可同时检测所述三种食源性寄生虫的试剂盒。