一种基于TRIZOL裂解液的无氯仿无相分快速提取RNA的方法及其应用

本发明属于核酸提取，具体涉及一种基于trizol裂解液的无氯仿无相分快速提取rna的方法及其应用。

背景技术：

1、rna提取在生物学研究和医学中至关重要，是研究基因表达和转录组分析的基础，有助于揭示基因功能和疾病机制。在临床医学上，rna提取可以用于疾病诊断、预后评估和个性化治疗，是推动精准医学发展以及提高其治疗效果和研究深度的基础。

2、利用trizol法提取rna长久以来被认为是获取rna的“黄金标准”。其中，trizol溶液是由苯酚、异硫氰酸胍和其他专有成分组成的单相溶液，具有卓越的裂解多种复杂样本的能力，裂解能力强且适用范围广，可以轻松扩展以适应非常大的输入量，进而能够回收充足的rna产量（应该是当前提取rna产率最高的方法），同时还能有效灭活rnases，防止样本在纯化过程中降解。总体而言，trizol能够保持rna的质量、完整性和产量，使其既可以作为储存介质，又可以作为提取/纯化溶液，是目前高效提取rna的主流经典方法。trizol法提取rna的基本步骤为：在trizol溶液中溶解和均质化样本后，通过添加氯仿等溶剂促进溶液相分离，此时rna主要存在于上层水相中，而dna和蛋白质脂质则分别存在于中间层和下层有机相中，之后提取上层水相并通过异丙醇沉淀和乙醇漂洗等步骤进而实现rna的分离纯化。然而，虽然trizol具有高效裂解多种复杂样本、高rna产量、有效灭活rnase防止rna降解、可同时提取rna，dna和蛋白质等优点，但是其操作繁琐、周期长，需要使用有毒试剂氯仿，且需要长时间离心和多步沉淀步骤，另外吸取上层rna水相时，还要求具备较高的操作技巧以确保rna的回收率和质量，防止操作不当而出现酚、蛋白质和dna的交叉污染。这些缺点使得传统的trizol rna提取法在处理多个样本时可能会显得繁琐，不适用于高通量自动化处理平台的发展。

3、硅胶核酸提取技术是分子生物学领域的一项开创性发现，由 boom等人在1990年发现，他们发现硅胶膜在特定条件下（如高盐和特定ph值）能够选择性地结合核酸，进而通过调控盐浓度和ph值能够实现核酸的高效分离纯化。该技术最初首先是应用于dna提取，后来才发展出适用于rna提取的方法，其基本步骤包括细胞裂解、硅胶结合、漂洗和核酸洗脱等过程。由于其具有操作简便，易于掌握，纯化时间短，不使用酚和氯仿等有毒试剂，不需要分层纯化，可实现自动化高通量处理等明显优势，进而成为了生物学研究中广泛应用的核酸提取方法。目前，市面上的rneasy kits (qiagen)和purelink rna mini kit(invitrogen)等试剂盒都是应用该原理实现rna高效分离纯化的代表。总体而言，这类不需要氯仿和分层的rna提取方法，简化了操作步骤，并提高了安全性，为rna提取/纯化提供了一种高效且可靠的手段，适用于多数实验室的日常使用，尤其是在需要处理大量样本或高通量实验时优势明显。然而，由于此类方法使用新的裂解溶液替代trizol试剂（而trizol试剂是目前最高效的裂解溶液，且具有广阔的适用范围），导致其在面临难以裂解的复杂样品或者容易降解的复杂样品时，仍表现出一定的局限性。目前，trizol法仍然是许多实验室的首选，但这些改进的技术为研究人员提供了更多选择。

4、考虑到trizol使用的普遍性及其强大的裂解能力和广泛的适应性，如果能以trizol试剂作为硅胶核酸提取的裂解液，兼容硅胶核酸提取的流程，即无氯仿无相分离，仅需要细胞裂解、硅胶结合、漂洗和核酸洗脱等过程，则有望在降低操作繁琐性的同时，提高rna提取/纯化的裂解能力和适用范围，以适应高通量自动化平台的发展。因此，有必要基于trizol裂解液开发一种无氯仿无相分的rna提取方法。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于trizol裂解液无氯仿无相分的硅胶核酸提取方法，该方法综合了传统trizol提取和硅胶核酸提取的技术优点，简化操作流程，无需操作技巧，环保安全，既拥有trizol试剂广阔的适用范围，又综合了硅胶核酸提取技术方便快捷、样品处理标准化一致性高的特点，使其适应高通量发展的需求。

2、为了实现上述目的，针对传统trizol提取方法需要加入氯仿，需要长时间离心制造相分离水相，吸取水相有技术要求，同时容易引入苯酚，dna和蛋白质等其它杂质造成污染，实验耗时长，不兼容高通量自动化平台的发展。同时，传统硅胶核酸提取试剂盒采用非trizol裂解液，虽然避免了氯仿和分层的步骤，但是由于裂解能力的问题，可能在一些难以裂解的复杂样品上处理有限。本发明提出了一种以trizol试剂作为硅胶核酸提取裂解液的构思。首先以trizol溶液为裂解液，测试了trizol试剂与市面购买的硅胶柱的兼容性，判断在trizol溶液背景下，rna能否与硅胶柱结合，同时摸索优化rna漂洗液1和rna漂洗液2的组分，使漂洗纯化后的纯度高【od260/280（大于1.8）和od260/230（大于1.8）】，能兼容核酸质谱及高通量测序的最高标准。再者，摸索了硅胶与rna结合的最适乙醇体积比（样品:乙醇=1：1），使硅胶在结合核酸时能提供最大结合能力。

3、另外，本发明还发现，若直接简单的将trizol试剂与硅胶核酸提取法相结合，即直接将trizol试剂加乙醇与硅胶柱进行结合的方法，其提取的rna总量只能达到传统氯仿相分提取的60%左右，猜测该抑制作用可能来自于trizol溶液当中的苯酚成分对rna和硅胶柱结合的影响。因而本发明进一步开发了一种trizol结合液来减缓苯酚的抑制作用，最终的rna产量与传统氯仿相分的方式相当甚至超越，同时整个提取纯化流程最快时仅需为5min（传统trizol rna提取法大于1h甚至过夜）， 操作简便、一致性高，可以适应样品高通量自动化平台的处理需求。再有，在实验中本发明还意外发现当trizol样品与trizol结合液结合使用时，在一定的乙醇浓度下，硅胶柱对于rna大片段（大于250bp）和小片段rna(小于250bp)具有不同的结合偏好性，基于此，本发明开发了相应的流程，初步实现了rna大小片段的选择性分离。当前，领域内一直认为dna片段大小可以通过beads纯化的方式进行初步分离（ampure xp beads技术），而rna片段由于具有结构而无法通过结合时的筛选实现大小分离。目前，rna片段大小分离主要依赖于凝胶系统割胶回收，其操作复杂、流程长、rna容易降解。而本发明为rna大小片段的分离特别是小rna的分离纯化提供了实验流程和补充，有利于进一步促进rna核酸提取领域的发展。

4、进一步地，本发明所采用的技术方案是：

5、本发明第一方面提供了一种基于trizol的硅胶核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括trizol试剂、rna漂洗液1、rna漂洗液2和trizol结合液；所述rna漂洗液1包括80%乙醇和0-8m盐酸胍，所述rna漂洗液2为70%-80%乙醇，所述trizol结合液包括8m异硫氰酸和0-300mmnaac ph5.2。

6、优选地，所述rna漂洗液1包括80%乙醇和0-1m盐酸胍，所述rna漂洗液2为80%乙醇，所述trizol结合液包括8m异硫氰酸和300mm naac ph5.2。针对rna漂洗液1，对于常规组织细胞样品，不加盐酸胍仍能保持合适的核酸纯度，但是如若组织细胞样品蛋白含量高，需要添加盐酸胍成分，该组分有利于蛋白污染的去除。

7、优选地，所述试剂盒还包括无水乙醇。

8、本发明第二方面提供了一种基于trizol和硅胶的无氯仿无相分快速提取rna的方法，该方法利用第一方面所述的试剂盒进行rna提取，提取流程包括以下步骤：

9、s1、将样品的trizol匀浆与1-3倍体积的trizol结合液混匀，再加入混合液1/2-1倍体积的无水乙醇混匀；

10、s2、将s1的混合液与硅胶柱孵育，使rna和硅胶柱的结合；

11、s3、往硅胶柱中添加rna漂洗液1进行漂洗；

12、s4、往硅胶柱中添加rna漂洗液2进行漂洗，之后空甩、纯水洗脱，即得。

13、本发明第三方面提供了一种基于trizol和硅胶实现rna大小片段选择性分离的方法，该方法利用第一方面所述的试剂盒进行rna提取分离，提取流程包括以下步骤：

14、s1、将样品的trizol匀浆与1-2倍体积的trizol结合液混匀，再加入混合液1/4-1/3倍体积的无水乙醇混匀；

15、s2、将s1的混合液与硅胶柱孵育，使rna和硅胶柱的结合；

16、s3、往硅胶柱中添加rna漂洗液1进行漂洗；

17、s4、往硅胶柱中添加rna漂洗液2进行漂洗，之后空甩、纯水洗脱，即得大于250bp的rna大片段组分；

18、s5、收集s2的流穿液，加入一倍体积的乙醇后与新的硅胶柱孵育，再经s3和s4的漂洗步骤后即得小于250bp的rna小片段组分。

19、优选地，针对上述的两种方法，s2中，孵育的时间为1-3min，孵育后10000-20000g离心30s-1min。

20、优选地，针对上述的两种方法，s3中，添加300-600μl rna漂洗液1，10000-20000g离心漂洗30s-1min。

21、优选地，针对上述的两种方法，s4中，添加600-800μl rna漂洗液2，10000-20000g离心漂洗30s-1min，共漂洗2-4遍。

22、优选地，针对上述的两种方法，s4中，空甩1-2min，纯水10000-20000g洗脱1-3min。

23、优选地，针对所述的基于trizol和硅胶实现rna大小片段选择性分离的方法，s1中，当采用1倍体积的trizol结合液时，再加入混合液1/4倍体积的乙醇；当采用2倍体积的trizol结合液时，再加入混合液1/3倍体积的乙醇。

24、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

25、本发明公开了一种基于trizol裂解液无氯仿无相分的硅胶核酸提取方法，该方法综合了传统trizol提取和硅胶核酸提取的技术优点，简化操作流程，环保安全，使其适应高通量发展的需求。同时，本发明开发了一种trizol结合液（8m异硫氰酸和0-300mm naacph5.2），通过该溶液能抵消苯酚对rna和硅胶柱结合的抑制作用，使其达到甚至超越使用氯仿分层所获得的产量。而且，还开发了与此兼容的rna漂洗液1（80%乙醇和0-8m盐酸胍）和rna漂洗液2（70%-80%乙醇），使其纯化后的纯度（od260/280和od260/230）达到兼容核酸质谱及高通量测序的最高标准。此外，还意外发现利用本发明开发的trizol结合液与硅胶处理样品相结合，在一定乙醇浓度下可以初步实现rna大小片段的分离，为rna大小片段的分离特别是小rna的分离纯化提供了新的方法。