用于分析生物材料的表面活性剂的制作方法

本发明涉及用于分析方法的材料领域，并且涉及用于微流体装置的组合物。

背景技术：

1、在1990年代中期，微制造技术的进步允许生产具有小至几微米的特征尺寸的装置。微机械加工、光刻、硅和玻璃基质的蚀刻都产生了流动通道网络，这些通道可以分类试剂和分子、分配化学反应，并作为水基和油基流体混合物的液滴发生器。这些微流体装置非常适合于进行生物化学测定，例如单细胞测定、大分子(例如蛋白质和核酸)的研究以及聚合酶链式反应(pcr)。

2、到2000年代早期，正在研究油包水乳液用于设计为将生物材料分配成纳升/皮升级液滴的潜在应用。显著的进步是在油基连续相中使用表面活性剂以保持引入不连续水相后形成的液滴的完整性。由于在充油微流体装置中使用了表面活性剂，液滴可以汇集在加宽的通道或储存器中，彼此接触而不会破裂或熔化。油-表面活性剂填充通道的广泛流体网络可被设计成协调栓塞或液滴的有意混合以介导生化反应。

3、与氟化表面活性剂组合的氟化油尤其可用于处理水性液滴内的生物分子(holtzeet al.、biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions、2008、8(10)、1632–1639)。

4、然而，含有氟化油的乳液可能具有本领域中确定的各种缺点。例如，水性液滴通常漂浮在氟化油中(氟化油的密度高于水的密度)，这可能增加液滴形成和操纵的复杂性：在一些情况下，需要目视检查pcr混合物沉积；乳液可能需要去除液滴下方的过量油以将液滴定位成更靠近热源，和/或入口孔中的pcr混合物位置可能对微流体芯片的倾斜敏感。

5、此外，漂浮的液滴可更可能由于暴露于乳液上方的空气而受损，特别是当加热时，pcr混合物对蒸发敏感，导致样品沉积和样品分析之间的时间限制，并且在一些情况下，必须使用密封油以防止蒸发。

6、因此，例如在wo2014/145582中已经提出了替代体系，其描述了包含设置在连续相中的水性液滴的乳液，所述连续相包含硅油和聚硅氧烷表面活性剂，其中聚硅氧烷表面活性剂由以下通式[聚硅氧烷主链][烷基]x[聚醚]y[聚硅氧烷]z来描述，其x为0-5，y为1-35，并且z为2-50。

7、wo2017070363还公开了用于微流体装置的填料流体，其包含硅油和溶解在硅油中的硅氧烷嵌段共聚物，其中硅氧烷嵌段共聚物基本上不与水性液体混溶。

8、然而，鉴定与分子生物学相容的合适的表面活性剂/油系统是改进数字pcr性能的主要目的。

9、与分子生物学的相容性是指系统不应损害分子生物学中使用的主要反应方案，例如pcr。

10、值得注意的是，数字pcr性能涵盖液滴稳定性(意味着当彼此接触时，基本上防止液滴混合和合并)，对于给定体积的pcr混合物，液滴数量的增加伴随着随之而来的分析体积的增加，以及最终避免漂浮的液滴。

11、当装载微流体芯片时，简化pcr混合物沉积和定位，防止pcr混合物蒸发以避免样品浪费，并最终最小化死体积(dead volume)，即不能被分析的样品体积，也是重要的目标。

12、发明概述

13、申请人鉴定了一类新的表面活性剂和油/表面活性剂体系，其与分子生物学相容，改进数字pcr性能并限制了样品浪费和死体积。

14、申请人确实证明，与其它表面活性剂相比，根据本发明的表面活性剂防止液滴在彼此接触时混合和合并，并增加液滴数和分析体积。

15、液滴数和分析体积的增加确保数字pcr定量的精度和不同群体之间荧光信号的可分离性，这是确定数字pcr的稳健性和精度的关键参数。

16、此外，根据本发明的油/表面活性剂体系的密度比与氟化体系相比是相反的，因此有利于芯片装载，防止样品浪费和使死体积最小化。这些是测定准确性和再现性的主要改进。

17、最后，由于硅油与氟化油相比的密度比反转，pcr混合物也被保护免于蒸发，因此允许芯片装载和处理之间的延长的操作时间。

18、发明详述

19、用于分析生物材料的方法

20、在一个实施方案中，本发明涉及用于分析生物材料的方法，包括：

21、-形成包含所述生物材料的乳液，包含：

22、-包含硅油的连续油相；

23、-分散的水相；

24、-表面活性剂，其为包含嵌段[a]、[b]和[c]的嵌段共聚物；

25、-在所述乳液中处理所述生物材料；和

26、-在所述乳液中检测所述生物材料，其中：

27、-所述表面活性剂的嵌段[a]对应于式(i)的嵌段

28、

29、其中r1是c1-c18烷基，并且m为10-100；

30、-所述表面活性剂的嵌段[b]对应于式(ii)的嵌段

31、

32、其中q为2-18，n为1-50，并且r2选自下组化合物：

33、·式(iii)

34、

35、·式(iv)

36、

37、·式(v)

38、和

39、·式(vi)

40、

41、其中r、s、t、u、v和w为1-32并且r3选自下组：-oh、-o-ch3和-o-ch2ch3；

42、-所述表面活性剂的嵌段[c]对应于式(vii)的嵌段

43、

44、其中p为5-300；

45、其中末端基团选自下组：-h、-ch3和-si(ch3)3；

46、并且其中所述表面活性剂的通式选自[a]-[b]-[c]、[b]-[c]-[a]、[c]-[a]-[b]、[b]-[a]-[c]、[a]-[c]-[b]和[c]-[b]-[a]。

47、硅油和表面活性剂在数字pcr中作为油相的用途

48、在一个实施方案中，本发明涉及硅油和表面活性剂在数字pcr中作为油相的用途，其中所述表面活性剂为包含嵌段[a]、[b]和[c]的嵌段共聚物，其中：

49、-所述表面活性剂的嵌段[a]对应于式(i)的嵌段

50、

51、其中r1是c1-c18烷基，并且m为10-100；

52、-所述表面活性剂的嵌段[b]对应于式(ii)的嵌段

53、

54、其中q为2-18，n为1-50，并且r2选自下组化合物：

55、·式(iii)

56、

57、·式(iv)

58、

59、·式(v)

60、和

61、·式(vi)

62、

63、其中r、s、t、u、v和w中的每一个为1-32并且r3选自下组：-oh、-o-ch3和-o-ch2ch3；

64、-所述表面活性剂的嵌段[c]对应于式(vii)的嵌段

65、

66、其中p为5-300；

67、其中末端基团选自下组：-h、-ch3和-si(ch3)3；

68、并且其中所述表面活性剂的通式选自[a]-[b]-[c]、[b]-[c]-[a]、[c]-[a]-[b]、[b]-[a]-[c]、[a]-[c]-[b]和[c]-[b]-[a]。

69、用于微流体装置的连续油相

70、在一个实施方案中，本发明涉及用于微流体装置的连续油相，其包含硅油和表面活性剂，其中所述表面活性剂为包含嵌段[a]、[b]和[c]的嵌段共聚物，其中：

71、-所述表面活性剂的嵌段[a]对应于式(i)的嵌段

72、

73、其中r1是c1-c18烷基，并且m为10-100；

74、-所述表面活性剂的嵌段[b]对应于式(ii)的嵌段

75、

76、其中q为2-18，n为1-50，并且r2选自下组化合物：

77、·式(iii)

78、

79、·式(iv)

80、

81、·式(v)

82、和

83、·式(vi)

84、

85、其中r、s、t、u、v和w中的每一个为1-32并且r3选自下组：-oh、-o-ch3和-o-ch2ch3；

86、-所述表面活性剂的嵌段[c]对应于式(vii)的嵌段

87、

88、其中p为5-300；

89、其中末端基团选自下组：-h、-ch3和-si(ch3)3；

90、并且其中所述表面活性剂的通式选自[a]-[b]-[c]、[b]-[c]-[a]、[c]-[a]-[b]、[b]-[a]-[c]、[a]-[c]-[b]和[c]-[b]-[a]；

91、并且其中相对于所述连续油相的总重量，所述组合物包含至少0.5重量％的所述表面活性剂。

92、微流体装置

93、在一个实施方案中，本发明涉及微流体装置，其包含至少一个含有硅油和表面活性剂的室，其中所述表面活性剂为包含嵌段[a]、[b]和[c]的嵌段共聚物，其中：

94、-所述表面活性剂的嵌段[a]对应于式(i)的嵌段

95、

96、其中r1是c1-c18烷基，并且m为10-100；

97、-所述表面活性剂的嵌段[b]对应于式(ii)的嵌段

98、

99、其中q为2-18，n为1-50，并且r2选自下组化合物：

100、·式(iii)

101、

102、·式(iv)

103、

104、·式(v)

105、和

106、·式(vi)

107、

108、其中r、s、t、u、v和w中的每一个为1-32并且r3选自下组：-oh、-o-ch3和-o-ch2ch3；

109、-所述表面活性剂的嵌段[c]对应于式(vii)的嵌段

110、

111、其中p为5-300；

112、其中末端基团选自下组：-h、-ch3和-si(ch3)3；

113、并且其中所述表面活性剂的通式选自[a]-[b]-[c]、[b]-[c]-[a]、[c]-[a]-[b]、[b]-[a]-[c]、[a]-[c]-[b]和[c]-[b]-[a]。

114、表面活性剂

115、根据本发明，表面活性剂是包含嵌段[a]、[b]和[c]的嵌段共聚物。

116、在一个实施方案中，表面活性剂的嵌段[a]对应于式(i)的嵌段

117、

118、其中r1是c1-c18烷基，并且m为10-100。

119、以上通式中，除非另外规定：

120、-烷基表示含有1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、16、17、18个碳原子的直链或支链基团。合适的烷基的实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基等。因此，c1-c18烷基对应于含有1-18个碳原子的烷基。

121、在一个实施方案中，m为10-35，优选10-17或17-25。

122、在一个实施方案中，m为25-75。

123、在一个实施方案中，r1是c12烷基。

124、在一个实施方案中，r1是c16烷基。

125、在一个实施方案中，r1为c12烷基且m为10-35，优选10-17或17-25。

126、在一个实施方案中，r1为c16烷基且m为25-75。

127、在一个实施方案中，表面活性剂的嵌段[b]对应于式(ii)的嵌段

128、

129、其中q为2-18，n为1-50，并且r2选自下组化合物：

130、·式(iii)

131、

132、·式(iv)

133、

134、·式(v)

135、和

136、·式(vi)

137、

138、其中r、s、t、u、v和w为1-32并且r3选自下组：-oh、-o-ch3和-o-ch2ch3。

139、在一个实施方案中，q是3。

140、在一个实施方案中，n为1-15，优选1-5。

141、在一个实施方案中，n为5-15。

142、在一个实施方案中，r、s、t、u、v和w为1-18，优选1-12，更优选6-9。

143、在一个实施方案中，r、s、t、u、v和w独立地等于1或10。

144、在一个实施方案中，r3是-oh。

145、在一个实施方案中，r2是式(iii)的化合物

146、

147、在一个实施方案中，r2是式(v)的化合物

148、

149、在一个实施方案中，r2是式(iii)的化合物

150、

151、其中r为6-9且r3是-oh。

152、在一个实施方案中，r2是式(v)的化合物

153、

154、其中t是10，u是1且r3是-oh。

155、在一个实施方案中，表面活性剂的嵌段[c]对应于式(vii)的嵌段

156、

157、其中p为5-300。

158、在一个实施方案中，p为5-200，优选75-175，更优选95-140。

159、在一个实施方案中，p为100-300。

160、在一种实施方式中，包含嵌段[a]、[b]和[c]的嵌段共聚物包含选自下组的末端基团：-h、-ch3和-si(ch3)3。

161、在一个实施方案中，末端基团是-ch3或-si(ch3)3。

162、在一个实施方案中，表面活性剂为包含嵌段[a]、[b]和[c]的嵌段共聚物，其中：

163、-所述表面活性剂的嵌段[a]对应于式(i)的嵌段

164、

165、其中r1是c1-c12烷基，并且m为10-35；

166、-所述表面活性剂的嵌段[b]对应于式(ii)的嵌段

167、

168、其中q为3，n为1-15，并且r2选自式(iii)化合物：

169、

170、其中r为6-9并且r3是-oh；

171、-所述表面活性剂的嵌段[c]对应于式(vii)的嵌段

172、

173、其中p为75-175；

174、其中末端基团选自下组：-h、-ch3和-si(ch3)3。

175、在一个实施方案中，表面活性剂为包含嵌段[a]、[b]和[c]的嵌段共聚物，其中：

176、-所述表面活性剂的嵌段[a]对应于式(i)的嵌段

177、

178、其中r1是c16烷基，并且m为25-75；

179、-所述表面活性剂的嵌段[b]对应于式(ii)的嵌段

180、

181、其中q为3，n为1-5或5-15，并且r2选自式(v)化合物

182、

183、其中u是1，t是10且r3是-oh；

184、-所述表面活性剂的嵌段[c]对应于式(vii)的嵌段

185、

186、其中p为100-300；

187、并且其中末端基团选自下组：-h、-ch3和-si(ch3)3。

188、在一个实施方案中，表面活性剂的通式为[a]-[b]-[c]。

189、在一个实施方案中，表面活性剂的通式为[b]-[c]-[a]。

190、在一个实施方案中，表面活性剂的通式为[c]-[a]-[b]。

191、在一个实施方案中，表面活性剂的通式为[b]-[a]-[c]。

192、在一个实施方案中，表面活性剂的通式为[a]-[c]-[b]。

193、在一个实施方案中，表面活性剂的通式为[c]-[b]-[a]。

194、根据一个实施方案，可用于根据本发明的体系中的表面活性剂可选自下组：以商品名abe 3642(cas no 212335-52-9)由销售的表面活性剂、以商品名j208-812(cas no 212335-52-9)由siltech公司销售的表面活性剂和以商品名t310-a-16(cas no 145686-34-6)也由siltech公司销售的表面活性剂。

195、在一个优选实施方案中，由以商品名abe 3642(cas no212335-52-9)商品化的表面活性剂可用作根据本发明的表面活性剂。

196、在一个优选实施方案中，表面活性剂包含15-50重量％的嵌段[a]的表面活性剂，优选18-50％，更优选20-40％。

197、在一个优选实施方案中，表面活性剂包含3-10重量％的嵌段[b]的表面活性剂。

198、在一个优选实施方案中，表面活性剂包含20-40重量％的嵌段[a]的表面活性剂、3-10重量％的嵌段[b]的表面活性剂和剩余重量的嵌段[c]的表面活性剂。

199、在一个实施方案中，表面活性剂包含30-35重量％的嵌段[a]的表面活性剂、7-10重量％的嵌段[b]的表面活性剂和剩余重量的嵌段[c]的表面活性剂。

200、典型地，通过rmn 1h分析估计重量百分比。

201、连续油相

202、根据本发明，连续油相包含硅油。

203、本文所用的硅油涵盖具有交替的硅和氧原子的骨架结构的分子，所述硅和氧原子通过与硅原子连接的烃彼此键合。硅原子可以被各种部分取代，例如烃部分。

204、硅油可根据其粘度和任选地根据其中可使用连续油相的微流体装置的设计来选择。

205、粘度可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量。典型地，可以使用常用的粘度计(如旋转粘度计)测量粘度。典型地，粘度计可以是适用于低粘度材料的粘度计。例如，可以与brookfield低粘度附件一起使用brookfield粘度计(ametek brookfield,11commerce blvd.,middleboro,ma 02346usa)，例如lvt、lvdv-e、dv1mlv、dv2tlv、dv3ltv。

206、在一个实施方案中，连续油相包含在25℃下粘度为0.5-500厘沲的硅油。

207、在一个实施方案中，连续油相包含在25℃下粘度为0.5-100厘沲的硅油。

208、在一个实施方案中，连续油相包含在25℃下粘度为0.5-50厘沲的硅油。

209、在一个实施方案中，连续油相包含在25℃下粘度在0.5-10厘沲的硅油。

210、在一个实施方案中，连续油相包含在25℃下粘度为0.7-5厘沲的硅油。

211、在一个实施方案中，连续油相的粘度在25℃下为0.8-4.0厘沲，优选在25℃下为0.9-3.0厘沲，更优选在25℃下为1.0-2.0厘沲。

212、典型地，连续油相的粘度在25℃下为1.1-1.5厘沲。

213、当用于例如在专利申请wo2020/109379和wo2020/109388中描述的opaltm微流体装置中时，在25℃下粘度为0.7-5厘沲的硅油是特别有利的。

214、在一个实施方案中，所述硅油包含十甲基四硅氧烷。

215、在另一个实施方案中，相对于所述硅油的总重量，所述硅油包含至少60重量％的十甲基四硅氧烷，优选相对于所述硅油的总重量，包含至少70重量％的十甲基四硅氧烷，更优选相对于所述硅油的总重量，包含至少80重量％的十甲基四硅氧烷，甚至优选相对于所述硅油的总重量，包含至少90重量％的十甲基四硅氧烷。

216、在另一个实施方案中，所述硅油还包含八甲基三硅氧烷和/或十二甲基五硅氧烷。

217、在一个实施方案中，连续油相包含1-10重量％的八甲基三硅氧烷和/或1-10重量％的十二甲基五硅氧烷。

218、在一个实施方案中，由商业化的产品dms-t01.5(casno:63148-62-9)可用作硅油。

219、在一个实施方案中，连续油相包含根据本发明的表面活性剂。

220、在一个实施方案中，相对于连续油相的总重量，连续油相包含0.5-5重量％的如先前所定义的表面活性剂，优选地，相对于连续油相的总重量，包含0.5-2.5重量％的如先前所定义的表面活性剂，并且更优选地，相对于连续油相的总重量，包含0.5-1.5重量％的如先前所定义的表面活性剂。

221、在一个实施方案中，相对于组合物的总重量，连续油相包含约1.0重量％的如先前所定义的表面活性剂。

222、在一个优选实施方案中，连续油相包含含有至少60％十甲基四硅氧烷的硅油和表面活性剂，所述表面活性剂为包含嵌段[a]、[b]和[c]的嵌段共聚物，其中：

223、-所述表面活性剂的嵌段[a]对应于式(i)的嵌段

224、

225、其中r1是c12烷基，并且m为10-35；

226、-所述表面活性剂的嵌段[b]对应于式(ii)的嵌段

227、

228、其中q为3，n为1-15，并且r2选自式(iii)化合物：

229、

230、其中r为6-9并且r3是-oh；

231、-所述表面活性剂的嵌段[c]对应于式(vii)的嵌段

232、

233、其中p为75-175；

234、并且其中末端基团选自下组：h、ch3和-si(ch3)3。

235、在另一个优选的实施方案中，连续油相包含含有至少60％十甲基四硅氧烷的硅油和表面活性剂，所述表面活性剂为包含嵌段[a]、[b]和[c]的嵌段共聚物，其中：

236、-所述表面活性剂的嵌段[a]对应于式(i)的嵌段

237、

238、其中r1是c16烷基，并且m为25-75；

239、-所述表面活性剂的嵌段[b]对应于式(ii)的嵌段

240、

241、其中q为3，n为1-5或5-15，并且r2选自式(v)化合物

242、

243、其中u是1，t是10且r3是-oh；

244、-所述表面活性剂的嵌段[c]对应于式(vii)的嵌段

245、

246、其中p为100-300；

247、并且其中末端基团选自下组：h、ch3和-si(ch3)3。

248、分散的水相

249、在一个实施方案中，分散相包含水和任何水可混溶的共溶剂，例如醚二醇和聚醚二醇、二甲基亚砜(dmso)、短链有机醇、丙酮、短链脂肪酸、甘油短链有机胺、过氧化氢、或有机和无机酸。

250、在一个实施方案中，分散相包含用于进行生物反应的试剂和生物材料。

251、生物材料

252、生物材料非限制性地指生物体、器官、组织、细胞(包括真核和原核细胞)、病毒或病毒颗粒、核酸(包括双链和单链dna或rna)、质粒、蛋白质、肽、抗体、酶、激素、生长因子、碳水化合物和脂质、及其衍生物、组合或聚合物。根据本发明的“生物材料”可以是天然或合成来源的材料。“生物材料”可以从生物样品提取、回收或直接获得，所述生物样品例如但不限于血液、尿液、脑脊液、精液、唾液、痰、粪便、组织或细胞。

253、在一个优选实施方案中，生物材料是指核酸。

254、乳液和液滴群

255、“乳液”是指包含至少两种液体的组合物，每种液体基本上不与另一种液体混溶，其中一种液体(其称为“分散相”)被分配到另一种液体(其称为“连续相”)中。乳液的分散相典型地以胶体、胶束、胶囊和/或液滴的形式悬浮。分散相和连续相典型地是完全不混溶的。乳液典型地通过在乳液中包含一种或多种表面活性剂和/或乳化剂来稳定。

256、在一个实施方案中，本发明还涉及分散在包含硅油和表面活性剂的连续油相中的包含水相的液滴群。

257、在标题为“分散的水相”、“连续油相”和“表面活性剂”的先前段落中详述的所有特征也适用于乳液和液滴群。

258、数字pcr

259、在一个实施方案中，处理生物材料的步骤包括扩增生物材料，优选通过数字pcr，更优选液滴中的数字pcr。

260、可以看出，数字pcr涵盖如下三种技术：

261、-微阵列中的数字pcr：

262、随着基于微流体的数字pcr变得公知和更广泛地实践，在2006年，fluidigm公司在集成微流体电路中商业化了该技术。biomark系统基于1275个数字阵列，12个板的芯片，其中每个板将反应流体分隔成765个6-nl室。在通过12个载体输入装载pcr反应混合物后，将芯片热循环，检测荧光，并通过数字pcr分析软件处理和分析信号。

263、-微滴中的数字pcr：

264、在解决成本/反应限制的同时进一步提高产量和灵敏度的替代方法是通过提供比基于室的系统多得多的分区的流动聚焦来产生皮升大小的微滴反应器。在微流体系统中产生液滴，热循环以在液滴内进行单分子数字pcr，并通过实时荧光曲线检测和定量终点扩增。这些基于液滴的芯片实验室系统也适用于进行逆转录pcr(rt-pcr)以检测rna基因组的单拷贝和进行针对单个液滴内多个靶标的多重反应。

265、该技术例如在2011年由quantalife公司作为qx100 ddpcrtm系统商业化。在ddpcrtm平台上使用的微流体消耗品可以容纳多达8个样品/芯片，产生14,000-16,000个液滴/样品。

266、-crystal digitalpcrtm：

267、系统是一种先进的数字pcr设备，于2016年由stilla technologies推出。该系统通过使用限制梯度将样品分成大的2d液滴阵列(也称为液滴晶体)来进行数字pcr。pcr反应发生在组成液滴晶体的分割的25-30,000个液滴的每一个中，并且通过拍摄晶体的高分辨率图像在终点进行荧光读出。

268、因此，本文使用的术语“数字pcr”涵盖但不限于微阵列中的数字pcr、微滴中的数字pcr和crystal digital pcrtm，并且术语“微滴中的数字pcr”涵盖微滴中的数字pcr和crystal digital pcrtm。

269、在一个实施方案中，处理生物材料的步骤包括扩增生物材料，优选通过数字pcr，更优选通过液滴中的数字pcr。

270、微流体装置

271、根据本发明的硅油/表面活性剂体系在包含液滴室的微流体装置中是有利的。

272、当根据本发明的油/表面活性剂体系的密度比与氟化体系的密度比相反时，当pcr混合物下沉接近液滴室时，便于芯片装载，防止样品浪费并且使死体积最小化。

273、根据本发明的系统在opal微流体装置中是特别有利的，例如在专利申请wo2020/109379和wo2020/109388中所描述。

274、opal微流体装置包括至少一个入口微通道、一个液滴室、一个出口通道和被配置为接收样品液滴的装载孔。

275、在氟化系统的情况下，pcr混合物漂浮在微流体芯片的装载孔中。因此，可能需要检查混合物沉积以确保pcr混合物被适当地注入微流体芯片中。此外，由于液滴在装载孔中的漂浮特性，孔中的混合位置对芯片的倾斜敏感。

276、相反，在根据本发明的系统的情况下，pcr混合物沉入与微流体芯片的注射器邻近的装载孔中。因此，混合物位置对倾斜不太敏感，并且在混合物移液之后不需要检查。因此，便于芯片装载。

277、此外，由于密度比相反，还保护pcr混合物免于蒸发，允许芯片装载和处理之间的延长的操作时间，并避免分配密封油的补充步骤。这也是防止样品浪费和最小化死体积的主要改进。

278、通过以下实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

技术实现思路