一种用于治疗肺损伤的外泌体及其制备方法及应用与流程

本发明属于生物，特别是一种用于治疗肺损伤的外泌体及其制备方法及应用。

背景技术：

1、外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

2、所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，能够应用于多种医疗用途。

3、肺脏是人体内的非常重要的器官之一，因此，肺脏的损伤会诱发一系列肺脏疾病，这其中，包括了肺纤维化、支气管炎、肺大泡、肺脓肿、肺炎、气胸、肺结核、肺部结节、肺气肿、肺部肿瘤、慢性阻塞性肺部疾病、肺栓塞等。

4、因此，对于肺损伤的修复直接关系到肺脏器官的正常工作与否，与人体健康具有较大的关联。

5、基于此，提供一种用于治疗肺损伤的外泌体，来解决现有的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于治疗肺损伤的外泌体及其制备方法，以弥补现有技术中的不足。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种用于治疗肺损伤的外泌体，所述用于治疗肺损伤的外泌体来源于水生动物细胞；

4、所述水生动物为淡水鱼类；

5、所述淡水鱼类包括：鲫鱼、草鱼、青鱼、黑鱼、鲶鱼；

6、所述用于治疗肺损伤的外泌体含有蛋白质、mirna、mrna；

7、其中，蛋白质中包括了特异性蛋白，所述特异性蛋白为：cd9、cd63、cd82、epcam；

8、所述用于治疗肺损伤的外泌体外泌体直径为80-85nm。

9、作为进一步的技术方案，所述水生动物细胞为水生动物胎胚细胞。

10、作为进一步的技术方案，所述水生动物胚胎细胞为鲫鱼、草鱼、青鱼、黑鱼、鲶鱼中任一种胚胎细胞。

11、作为进一步的技术方案，所述水生动物胚胎细胞经过分离培养而获得：

12、具体方法包括：

13、首先，采用胰蛋白酶消化法自原肠期水生动物内分离胚胎细胞；

14、将分离出的胚胎细胞接种到培养基中，在27.5℃、5％二氧化碳浓度下，进行培养7-8天，每隔3天更换一次培养液，培养完成后，得到水生动物胚胎细胞培养液；

15、其中分离出的胚胎与培养基混合质量比为1:10-12。

16、作为进一步的技术方案，所述分离胚胎细胞的方法为：

17、取自然交配受精的水生动物的受精卵，采用灭菌的纯净水进行清洗，然后取其中的30-35枚胚胎至培养皿中，添加其质量5倍的胰蛋白酶处理液进行处理2min，再加入等体积的dmem培养液进行终止消化1min，经过高速离心处理3-4min，弃去上清液得到分离胚胎，其中，高速离心的转速为1000r/min；

18、所述胰蛋白酶处理液制备方法为：

19、将0.25g胰蛋白酶，0.05g乙二胺四乙酸依次添加到95ml pbs缓冲液中，经过磁力搅拌至完全溶解，定容至100ml；

20、再经过0.22μm过滤膜进行过滤，即得；

21、所述dmem培养液制备方法为：

22、取13.4g高糖dmem干粉、3.7g碳酸氢钠、新生小牛血清，添加到900ml蒸馏水中，经过磁力搅拌器搅拌至完全溶解，再定容1000ml，调ph7.1，经过0.22μm滤膜过滤，即得；

23、所述dmem培养液中新生小牛血清质量分数为11.2％。

24、作为进一步的技术方案，所述培养基制备方法为：

25、将60g的m199培养基干粉溶于600ml的去离子水中，然后再添加16g的碳酸氢钠，搅拌混合均匀，再定容至1000ml，然后再添加经过灭菌后的新生小牛血清、灭菌后的水生动物自身血清，丙酮酸钠、整合素α5β1、成纤维生长因子、青霉素和链霉素，搅拌混合均匀后，调节ph值至7.3，经过0.22μm滤膜过滤除菌，在4℃保存备用；

26、作为进一步的技术方案：

27、所述新生小牛血清在培养基中质量分数为8-9％；

28、所述水生动物自身血清质量分数为0.6-0.8％；

29、所述丙酮酸钠浓度为0.7-0.8mmo l/l；

30、所述整合素α5β1浓度为0.5-0.7mmo l/l；

31、所述成纤维生长因子浓度为3-3.5ng/ml；

32、所述青霉素浓度为75ui/ml；

33、所述链霉素浓度为75ui/ml。

34、一种用于治疗肺损伤的外泌体制备方法，包括：

35、1)对水生动物胚胎细胞培养液进行一次离心，取一次上清液；

36、2)对一次上清液进行二次离心，取二次上清液；

37、取二次上清液进行三次离心，取三次上清液，采用pbs缓冲液对三次上清液进行150000g超速离心1小时，收集沉淀并用pbs缓冲溶液进行重悬沉淀得到粗品，经过阴离子交换柱层析纯化，得到所需外泌体；

38、用于阴离子交换柱层析的阴离子交换体采用：captommc；

39、阴离子交换柱层析在0.85m的nacl的存在下进行，阴离子交换柱层析的柱条件选择柱洗脱液的ph为7时洗脱。

40、作为进一步的技术方案，步骤1)离心条件为在3000g下，离心15-20min；

41、步骤2)离心条件在30000g下，离心30-35min；

42、步骤3)离心条件为100000g下，离心2-2.5h。

43、本发明方法制备的外泌体应用于治疗肺损伤。

44、有益效果：

45、本发明制备的用于治疗肺损伤的外泌体具有体积小，逃避吞噬、易于穿过呼吸道内膜层等多种特性，能够用于制备肺损伤用药物，调节肺部细胞修复机制，缩短肺部损伤修复的进程，提高肺部损伤修复效果。

46、本发明通过在培养基中引入了整合素α5β1与丙酮酸钠，二者配合作用，能够具有诱导促进外泌体生成的作用，从而能够一定程度上提高外泌体的提取浓度。

47、经过大量试验研究，本发明通过采用了来源于水生动物的胚胎细胞所得到的外泌体，通过其引入，其具有一定的特异性，主要表现为对丝氨酸/苏氨酸激酶39的表达的抑制，而对于其表达受到抑制后，会促使肺泡巨噬细胞自噬，可以降低炎症因子的水平并抑制肺部炎症和氧化应激，进而缓解肺部的损伤，增强肺部功能。

48、本发明制备的外泌体可以被肺部吸收，这样能够有效的提高了外泌体载药的传递效率和发挥着积极的抗炎效果，加速肺部损伤的修复。

49、由于本发明制备的水生动物胚胎外泌体具有低毒性、低免疫原性等独特的生物学特性，并且能够实现增强免疫、降低肺部炎症及修复肺部组织的作用，因此，对于肺部损伤组织症状具有显著的治疗、缓解等作用。

50、采用本发明制备的外泌体应用到肺部损伤中，会一定程度上激活凋亡基因进而促进平滑肌细胞凋亡而排出体外，这样促进了细胞肺部增殖，从而促进了肺部组织的修复，能够实现肺部细胞增殖和凋亡的平衡，保障了血管壁细胞健康，确保了血液中营养成分的正常输送，提高肺部细胞组织的修复效率。

51、本发明所得到的外泌体可以采用雾化或静脉输注的方式，通过调控肺部损伤组织的微环境、启动自我修复程序,通过恢复线粒体完整性促进巨噬细胞向抗炎表型转变,进而起到抗炎、修复肺上皮组织的作用，并且能够达到促进血管新生的效果。