一种脂肪类器官血管化的制备方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种脂肪类器官血管化的制备方法。

背景技术：

1、肥胖症是一组常见的代谢症群。肥胖症的糖、脂代谢进食过多的热量促进甘油三酯的合成和分解代谢，肥胖症的脂代谢表现得更加活跃，相对糖代谢受到抑制，这种代谢改变参与胰岛素抵抗的形成，由肥胖及其引发的糖尿病，脂肪肝，高血脂症等疾病已成为威胁人类健康的世界性问题。研究脂肪发育及其代谢机制对于研发减脂药物，抑制肥胖具有重要意义。

2、脂肪组织，是一种储备中性脂肪的疏松结缔组织。细胞中聚集大量脂肪,以致核和细胞器都被挤到细胞一侧。皮下，特别是肥胖动物的皮下、肠系膜上都富有脂肪组织。脂肪组织中网状纤维很发达。

3、大多数哺乳动物拥有两种脂肪组织：白色脂肪组织(white adipose tissue，wat)和棕色脂肪组织(brown adipose tissue，bat)。白色脂肪细胞主要通过合成甘油三脂储存机体代谢过剩的能量，而棕色脂肪细胞中富含线粒体，能通过消耗脂肪酸中的能量产热。2024年4月，一项发表于《自然·代谢》(nature metabolism)的研究表明，哺乳动物有一种名为ac3-at的蛋白质，能在bat激活后不久就将其关闭，这限制了通过激活bat来治疗肥胖的有效性。

4、大量的动物和临床实验已证实，动物脂肪细胞主要由中胚层细胞发育而来,中胚层细胞发育形成血管，随后处于血管旁基质细胞在成脂信号的诱导下发育形成脂肪细胞。脂肪来源血管基质成分高表达cd44、cd105与cd90，低表达cd14、cd19与cd45，脂肪来源血管基质成分具有向脂肪细胞、成骨细胞与软骨细胞分化的能力。但是这些基质细胞之间存在异质性，目前对于这种异质性的研究及其成脂过程中发生的变化还不够深入。动物脂肪沉积主要包括脂肪细胞的增生和肥大，相较于皮下脂肪，动物内脏脂肪组织随年龄增长更易沉积，引起胰岛素抵抗、糖尿病、血管粥样硬化等代谢疾病。因此研究内脏脂肪中脂肪干细胞的发育及脂肪沉积及代谢规律对于研究减脂药物，促进人类健康具有更重要的意义。目前，体外研究脂肪生物学的模型主要是从小鼠和人体脂肪组织中分离得到的原代脂肪血管基质组分(stromalvascularfractions，svf)。现已成功构建的前体脂肪细胞系较少，且这些前体脂肪细胞系组成单很难模拟体内脂肪组织中多种细胞共同形成的微环境，同时原代脂肪svf细胞又难以在体外进行高代次的增殖，并维持较强的成脂分化能力。传统的二维细胞培养也很难重现动物体内脂肪组织中单腔室成熟脂肪细胞及其分泌特性。虽然用于脂肪生物学模型研究的动物模型优于2d培养的细胞,其优点包括具有功能性的脉管系统、基质和免疫成分,但动物模型的局限性在于其不同的生理、药物代谢特征以及对遗传基因变异所致疾病的不同表型。同时在动物体内脂肪发育过程相较于体外细胞培养较为缓慢,研究其生物学功能所需的实验周期相对较长。这些都阻碍了人们对脂肪发育及功能的研究。

5、近年来，随着类器官技术的不断发展成熟，它已成为研究器官发育、组织微环境药物有效性和安全性的重要工具。类器官(organoid)是一种体外3d培养的能够形成立体组织结构的生物模型，可以作为多种疾病诊疗的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、肿瘤精准医疗、病因病理、药物开发等多个方面拥有广泛的应用前景。类器官作为一种新的“模式生物”,由于其组成、结构和功能与体内器官非常接近,可为探究人体发育、疾病发生机制及筛选高通量药物等提供一个全新的工具。

6、类器官是目前较易获得的3d培养物之一,利用干细胞及其分化的细胞通过细胞自我组织特性,可在体外建立类似于人体器官的模型。这些快速发展的模型在基础医学和临床研究中具有广泛的应用,例如分析干细胞的特征,以及在接近生理状态的条件下进行药物筛选和疾病建模等。在过去的十年里,血管化脂肪类器官已经被证明是脂肪沉积性疾病建模中有效的工具,并且正在成为一个越来越可行的选择。

技术实现思路

1、为了解决上面所提的问题，本发明一种脂肪类器官血管化的制备方法，包括以下步骤：

2、步骤一、悬滴法进行脂肪干细胞类器官的培养

3、将培养扩增后的人源脂肪干细胞胰酶消化后，msc完全培养基终止消化，采用悬滴法使脂肪干细胞形成三维脂肪干细胞球，悬滴培养2-3天，每个细胞球含有的细胞数为8000-10000；

4、步骤二、脂肪类器官血管化诱导

5、将已形成细胞球的脂肪干细胞转移至脂肪干细胞血管化诱导培养基，诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞定向，脂肪类器官血管化。

6、步骤三、成脂诱导

7、使用血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基对脂肪类器官进行成脂诱导定向，之后使用血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基对血管化脂肪类器官继续成脂诱导，使之形成成熟脂肪细胞的血管化脂肪类器官；

8、步骤四、维持培养

9、使用血管化脂肪类器官维持培养基培养血管化脂肪类器官，用于后续细胞活力及表型检测，培养得到的血管化脂肪类器官含有血管内皮细胞和成熟脂肪细胞。

10、优选的步骤一悬滴法进行脂肪干细胞类器官的培养是将培养扩增后的脂肪干细胞胰酶消化后，干细胞完全培养基终止消化，取300g，离心5min去上清，采用悬滴法使脂肪干细胞形成三维脂肪干细胞球，悬滴培养2-3天，后用脂肪类器官维持培养基dm培养备用，每个细胞球含有的细胞数为8000-10000，其中悬滴法是用脂肪类器官诱导分化培养基dm制备细胞悬液，细胞悬液细胞浓度在4×105-5×105/ml，以20μl单细胞悬液接种于细胞培养皿顶盖内侧，制备悬滴，在细菌或细胞培养板的底部加入无菌水，以维持湿度。

11、优选的步骤二脂肪类器官血管化诱导是将已形成细胞球的脂肪干细胞用1ml枪头转移至含有500μl脂肪干细胞血管化诱导培养基(zxim)的24孔超低吸附板中，每孔3-4个细胞球，将超低吸附板置于37℃，5％co2条件下2天，诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞定向，使用脂肪干细胞血管化诱导培养基在超低吸附板中悬浮培养诱导脂肪干细胞2天，诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞定向，使用paraflim封口膜和384孔pcr板构建多孔模具，将脂肪干细胞血管化诱导培养基培养两天的脂肪干细胞球转移至模具内，模具中每孔放置一个脂肪干细胞球，采用8～12mg/ml浓度基质胶包埋细胞球，包埋每个细胞球使用的基质胶用量为6-8μl，将模具置于细菌或细胞培养皿皿底，倒置放入37℃细胞培养箱30min，待基质胶固化后用脂肪干细胞血管化诱导培养基将含有脂肪干细胞球的基质胶转移至超低吸附板中继续悬浮诱导4～5天，2～3天换液，使其形成分支状血管结构；脂肪类器官血管化，血管化marker的表达cd31。

12、优选的步骤三成脂诱导是使用血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基(zx-o-zm1)对脂肪类器官进行3天的成脂诱导定向，之后使用血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基对血管化脂肪类器官继续成脂诱导10-12天，使之形成具有直径超过40μm成熟脂肪细胞的血管化脂肪类器官。

13、优选的步骤四维持培养是使用血管化脂肪类器官维持培养基(zx-o-zm3)培养血管化脂肪类器官6天，用于后续细胞活力及表型检测，培养得到的血管化脂肪类器官含有血管内皮细胞和成熟脂肪细胞。

14、本发明所述msc完全培养基包括以下浓度的组分：含有10％胎牛血清fbs，1×penicillin/streptomycin的dmem高糖培养基；

15、本发明所述脂肪干细胞血管化诱导培养基包括以下浓度的组分:

16、含有5％胎牛血清fbs，30ug/ml gentamicin sulfate(synonyms:硫酸庆大霉素)，15ng/ml amphotericin两性霉素，1ng/ml血管表皮生长因子veg，5ng/ml human egf,10ng/ml碱性生长因子fgf2,0.2ug/ml氢化可的松hydrocortisone,1ug/ml抗坏血酸ascorbicacid,20ng/ml r3胰岛素样生长因子1lr3-igf-1的内皮细胞基础培养基-2。

17、本发明所述血管化脂肪类器官成脂定向诱导培养基包括以下浓度的组分:

18、含有10％胎牛血清fbs，0.5mm 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，4μg/ml罗格列酮，1um地塞米松，10ug/ml胰岛素，2×glutamax、10μg/ml转铁蛋白,1×penicillin/streptomycin的dmem高糖培养基；

19、本发明所述血管化脂肪类器官成脂诱导维持培养基包括以下浓度的组分:

20、含有2％胎牛血清fbs，5ug/ml胰岛素，2×glutamax，1×penicillin/streptomycin的dmem高糖培养基；

21、本发明血管化脂肪类器官维持培养基包括以下浓度的组分:

22、含有10％胎牛血清fbs，2×glutamax，1×penicillin/streptomycin的dmem高糖培养基。

23、本发明脂肪类器官诱导分化培养基dm包括以下浓度的组分:

24、含有3％新生牛血清fcs，0.5mm 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，0.25μm地塞米松,0.2μm胰岛素，10μg/ml转铁蛋白的asc1培养基(不含fcs的asc2)。

25、本发明脂肪类器官维持培养基dm包括以下浓度的组分:

26、含有3％新生牛血清，0.25μm地塞米松,0.2μm胰岛素,10μg/ml转铁蛋白的asc1培养基(不含fcs的asc2)。即不含ibmx的脂肪类器官诱导分化培养基dm。

27、本发明的优点：

28、1、本发明脂肪类器官血管化的制备方法，流程简单、快速、高效。

29、2)本发明用到的自主研发的适用于人源脂肪干细胞类器官培养和传代及血管化诱导成脂培养的各种培养基，能够实现脂肪干细胞类器官血管化及成脂的高效构建、传代和扩增。

30、3)本发明脂肪类器官血管化使用悬滴法，培养成功率最高可达95％以上，培养周期较常规的培养方式提高2倍，7天左右即可传代。

31、4)本发明制备的血管化脂肪类器官为构建为脂肪发育及其代谢机制的研究提供了可靠的研究手段。