一种披发糖多孢菌来源的可降解生物胺的单胺氧化酶MAO7SH及其应用

本发明涉及一种披发糖多孢菌来源的可降解生物胺的单胺氧化酶mao7sh及其应用，属于分子生物学。

背景技术：

1、生物胺是一类具有显著生物活性的低分子含氮有机化合物，它们普遍存在于各类发酵食品中，如乳制品、鱼制品、肉制品、发酵蔬菜和酒精饮料等。这些物质的含量在不同食品中存在较大差异，并且通常较高，主要种类包括腐胺(put)、酪胺(tyr)、组胺(his)、尸胺(cad)、苯乙胺(phe)、色胺(try)、精胺(spe)和亚精胺(spd)等。大量研究表明，高剂量的生物胺会引起多种毒理学问题。值得注意的是，酒精的摄入能够加剧生物胺所致的不利生理效应，这表明生物胺是导致酒精饮料引发宿醉和头痛的关键因素之一。因此，提升这类发酵食品的品质，并严格控制其中生物胺的含量变得尤为关键。

2、研究表明生物胺不能通过加热烹饪去除，生物胺的生成只能在发酵过程中控制和减少。但是对于食品中已有的生物胺，最有发展前景和对发酵食品风味影响最小的方法是微生物酶解法来催化降解。微生物来源的胺氧化酶在降解食品的生物胺和保障食品安全具有重要作用。根据胺氧化酶含有辅基的不同，又可以分为含铜胺氧化酶和含黄素胺氧化酶2种。其中胺氧化酶分类下的单胺氧化酶(monoamine oxidase,mao)全名为单胺氧化还原酶，以fad为辅基，属于含黄素胺氧化酶。单胺氧化酶(mao)是一类存在于许多微生物中的酶，它们在生物胺的代谢过程中扮演着重要角色，与含铜胺氧化酶(以cu2+为辅基)不属于同一分类。这些酶具有将生物胺中的氨基氧化去除的能力，从而转化成相应的醛。具体来说，mao将生物胺的氨基(-nh2)氧化成亚氨基(-nh)，同时还原分子氧(o2)生成过氧化氢(h2o2)。所生成的亚氨基进一步水解形成对应的醛类化合物和氨(nh3)。这一过程对于控制和降解食品中生物胺的含量尤其关键。

3、胺氧化酶在降解配制溶液中的生物胺时有一定的效果但用于发酵食品中生物胺的降解时则会出现酶活显著降低或失活等问题；目前缺少单胺氧化酶用于降解发酵食品体系中组胺、酪胺、尸胺和腐胺等常见生物胺的报道，也没有相关酶学性质的研究。针对此关键问题，获取来源发酵食品的微生物的单胺氧化酶来理性调控降低生物胺的含量，对于提升发酵食品的品质，尤其是黄酒等具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有传统发酵食品中生物胺含量普遍较高的问题，提供一种批发糖多孢菌来源的可降解生物胺的单胺氧化酶，并用重组酶降解生物胺的方法来降低黄酒等发酵食品中的生物胺含量，提升传统发酵食品的品质。

2、本发明的第一个目的是提供一种单胺氧化酶，为(a)或(b)：

3、(a)由seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4、(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有单胺氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

5、本发明还提供编码所述单胺氧化酶的基因。

6、在一种实施方式中，所述基因含有seq id no.3所示的核苷酸序列。

7、本发明还提供了携带所述基因的重组表达质粒。

8、在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pet系列、duet系列、pgex系列、phy300、phy300plk、ppic3k、ppic9k或ptrc系列载体。

9、在一种实施方式中，所述pet系列载体包括pet24a(+)、pet28a(+)、pet29a(+)、pet30a(+)；所述duet系列载体包括prsfduet-1、pcdfduet-1；所述ptrc系列系列载体包括ptrc99a。

10、在一种实施方式中，所述重组表达质粒为pet28a(+)。

11、本发明还提供表达所述单胺氧化酶的重组微生物细胞。

12、在一种实施方式中，所述重组微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌或酵母菌。

13、本发明还提供一种基因工程菌，以大肠杆菌为宿主，表达seq id no.3所示的单胺氧化酶。

14、在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌bl21(de3)为宿主。

15、在一种实施方式中，所述基因工程菌以pet系列质粒为表达载体。

16、在一种实施方式中，所述基因工程菌以pet28a(+)为表达载体，表达seq id no.2所示的单胺氧化酶。

17、本发明还提供所述基因工程菌的构建方法，是将seq id no.2或seq id no.3所示的基因序列与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。

18、在一种实施方式中，所述载体为pet28a(+)。

19、在一种实施方式中，所述基因序列连接在pet28a(+)的nheⅰ和hindⅲ位点之间。

20、本发明还提供一种生产单胺氧化酶的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至培养基中进行培养，收集所述单胺氧化酶。

21、在一种实施方式中，所述方法是从细胞培养液中收集菌体细胞，破碎细胞获得含单胺氧化酶的粗酶液。

22、在一种实施方式中，所述方法还对粗酶液进行纯化。

23、在一种实施方式中，所述纯化包括但不限于亲和层析、凝胶过滤层析/分子筛、离子交换层析、硫酸铵沉淀/聚乙二醇(peg)沉淀等本领域熟知的纯化方法。

24、在一种实施方式中，所述亲和层析包括金属螯合亲和层析(如利用his标签纯化蛋白)、免疫亲和层析等。

25、在一种实施方式中，所述纯化采用镍柱亲和层析。

26、在一种实施方式中，所述培养是将所述基因工程菌接种至lb培养基中，培养至0d600为0.6-0.8时，用iptg诱导产酶。

27、在一种实施方式中，所述诱导是在16～37℃下诱导。

28、在一种实施方式中，所述iptg的终浓度为0.4～0.6mmol·l-1。

29、在一种实施方式中，所述诱导是在20℃下，200rpm诱导16h。

30、本发明还提供所述单胺氧化酶在降低生物胺方面的应用。

31、在一种实施方式中，所述应用是将所述单胺氧化酶与环境中的生物胺接触。

32、在一种实施方式中，所述环境包括液体环境、半固体环境或固体环境。

33、在一种实施方式中，所述应用包括降低发酵食品中的生物胺含量。

34、在一种实施方式中，所述发酵食品包括发酵乳制品、发酵豆类制品、发酵肉制品、发酵谷物制品、发酵蔬菜制品、发酵调味品或发酵酒精饮品。

35、在一种实施方式中，所述发酵乳制品包括但不限于酸奶或奶酪；所述奶酪包括但不限于切达奶酪、莫扎瑞拉奶酪、羊奶酪等。

36、在一种实施方式中，所述发酵肉制品包括但不限于香肠(如德国香肠、意大利萨拉米等)、火腿、熏肉、干肉、鱼露。

37、在一种实施方式中，所述发酵蔬菜制品包括但不限于泡菜、酸菜、韩式泡菜、酱菜等。

38、在一种实施方式中，所述发酵豆制品包括但不限于豆腐乳或纳豆。

39、在一种实施方式中，所述发酵调味品包括但不限于酱油、味噌、醋、豆瓣酱。

40、在一种实施方式中，所述发酵酒精饮品包括但不限于啤酒、葡萄酒、米酒。

41、在一种实施方式中，所述应用是将所述单胺氧化酶添加至黄酒中，降低其中的主要生物胺含量。

42、在一种实施方式中，所述应用是将所述单胺氧化酶加入黄酒中，于25～28℃反应至少24h或至少48h。

43、在一种实施方式中，所述生物胺包括但不限于色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺中的一种或多种。

44、本发明提供了一种降解生物胺的酶制剂，所述酶制剂中含有氨基酸序列如seq idno.1所示的单胺氧化酶。

45、在一种实施方式中，所述酶制剂还含有保护酶在生产、储存和使用过程中的稳定性，防止酶失活或降解的稳定剂。

46、在一种实施方式中，所述稳定剂包括但不限于糖类、多元醇类、蛋白类、多聚体、金属离子等。

47、本发明提供了一种降解环境体系中生物胺的方法，所述方法为，利用所述单胺氧化酶或表达所述单胺氧化酶的基因工程菌降解生物胺，所述单胺氧化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述环境体系非生物体内环境。

48、在一种实施方式中，所述环境体系包括不限于乳制品、鱼制品、肉制品、发酵食品。

49、在一种实施方式中，所述环境体系包括不限于黄酒、酱油、醋、低盐酱油、料酒、果酒、虾酱和鱼露等发酵食品。

50、在一种实施方式中，所述基因工程菌是以细菌或真菌为宿主细胞。

51、在一种实施方式中，所述生物胺包括但不限于色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺中的一种或多种。

52、本发明还提供了上述酶制剂或上述氨基酸序列如seq id no.1所示的单胺氧化酶或表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的单胺氧化酶的基因工程菌在制备降解环境体系中生物胺的产品中的应用。

53、本发明还提供了上述酶制剂或上述氨基酸序列如seq id no.1所示的单胺氧化酶或表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的单胺氧化酶的基因工程菌在制备发酵食品中的应用。

54、在一种实施方式中，所述发酵食品包括不限于发酵蔬菜、酒精饮料。

55、在一种实施方式中，所述发酵食品包括不限于黄酒、酱油、醋、低盐酱油、料酒、果酒、虾酱和鱼露。

56、在一种实施方式中，所述基因工程菌是以细菌或真菌为宿主细胞。

57、本发明还提供了上述酶制剂或上述氨基酸序列如seq id no.1所示的单胺氧化酶或表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的单胺氧化酶的基因工程菌在食品领域降解生物胺方面的应用。

58、有益效果：

59、(1)本发明提供的来自批发糖多孢菌的单胺氧化酶重组酶具有较强的降解生物胺的性能，该酶还具有一定的ph稳定性、温度稳定性，并能够耐受一定浓度的乙醇，有助于实现在酒精饮品中的对生物胺的降解。

60、(2)本发明还提供了所述单胺氧化酶mao7sh在降解发酵食品中生物胺方面的应用。该酶能够在48h内对于18％vol的市售黄酒降解色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺的降解率分别高达22.18％、14.25％、47.60％、25.36％、13.67％、8.53％、13.65％、0.71％。尤其体现了对于腐胺和尸胺的降解潜力，有助于发酵食品的安全性得到进一步提高。

61、(3)本发明还构建了表达单胺氧化酶mao7sh的重组大肠杆菌，通过在20℃，200r·min-1条件下诱导培养16h后，进行超声破碎，对收集的粗酶液的蛋白含量进行测定，结果显示，100ml的od为1的菌液中含有50mgmao7sh酶蛋白。