一种增强CHO-K1细胞瞬转产生抗体表达量的方法与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种增强cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量的方法。

背景技术：

1、当前与细胞瞬转产生抗体相关的技术，主要包括：以放大生产为目的的细胞大规模瞬转的方法、有利于提高瞬转效率的方法或培养基、为表达某种目的产物，构建质粒并通过瞬转的方法快速获得产物等。

2、现有技术，瞬转细胞宿主一般选用以hek-293细胞为主的哺乳动物细胞，其优势是表达量高，能够快速制备目的蛋白，cho细胞作为属源的成纤维细胞，相比hek-293细胞不易被人类病毒感染，且由于cho细胞在放大生产方面相比hek-293细胞更为稳定，因此已上市的抗体类药物绝大多数都是在cho细胞中表达。为了保持瞬转表达蛋白和稳定细胞株表达蛋白的一致性，越来越多的制药公司选择用cho细胞作为抗体类药物的瞬转表达宿主。但cho细胞作为瞬转表达的宿主，表达水平普遍偏低，尤其在结构复杂的双抗分子中，表达量通常低于20mg/l，大大限制了cho细胞在瞬时转染中的运用；且已有瞬转技术在瞬转流程上较繁琐，如习惯在瞬转前一天对于细胞密度进行调整。

3、因此需要设计出一种增强cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量的方法解决以上问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供一种增强cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量的方法，以克服目前现有技术存在的上述不足。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、一种增强cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量的方法，其特征在于：

4、其包括以下步骤：

5、细胞提取以及转移，用液氮将cho-k1q细胞株冻存管转移至水浴锅旁，将冻存管置于37.0℃±0.5℃水浴锅中静置解冻，解冻时间为120-150秒，过程中注意保持冻存管口始终高于水浴锅液面，解冻后立即将种子液转入装有39.0±1.0ml预热的balancd培养基的250ml摇瓶中，细胞密度在(0.30-0.60)×106cells/ml，且细胞活率≥85％；

6、对细胞进行细胞复苏以及种子扩增，将解冻后的细胞转移至已预热的balancdtransfectory cho培养基中进行传代扩增；

7、瞬转，将以及复苏以及扩增的细胞内导入特定的质粒；

8、分批补料培养，根据不同培养的情况进行灵活调整；

9、通过生物分子分析仪进行分析，得到数据内容；

10、具体瞬转包括以下步骤：

11、配制质粒溶液，将含抗体的轻链质粒的溶液、含抗体重链质粒的溶液以及瞬转培养基进行混合，并轻柔混匀制成；

12、配制转染复合物，将配制好的质粒溶液重加入pei试剂，并轻柔混匀，并静置得到转染复合物；

13、转染，将转染复合物放入待转染的cho-k1的细胞液中，同时加入细胞转染增强液，轻柔混匀，再进行分批补料培养。

14、优选的，具体的细胞进行细胞复苏以及种子扩增为，传代培养基为balancd，传代培养中根据最终生产的培养规模逐步提高接种密度，传代过程中应保证细胞活率≥90％。

15、优选的，种子细胞的培养参考设置，温度为37.0℃±0.5℃，co2浓度为5.0％，相对湿度为80％，摇床转速100rpm，摇床振幅为50mm。

16、优选的，瞬转工艺，瞬转培养基为balancd，瞬转pei试剂为fectopro，转染时的细胞密度为2.0～4.0×106cells/ml，质粒用量为0.5μg/ml，pei:dna之间的比例为2。

17、优选的，瞬转后的细胞培养工艺，瞬转初始培养温度为37℃，瞬转后24h降温至33℃继续培养，瞬转后开始取样检测细胞生长和生化参数，根据渗透压值灵活进行补料，结合补料中的含糖量，根据初始培养体积，添加400g/kg的葡萄糖母液至6.0g/l。

18、优选的，具体种子复苏与扩增包括细胞复苏与扩散阶段和n-1代阶段。

19、本发明的有益效果是：本技术方案通过pei试剂进行瞬转及特定的细胞转染后培养方式，以有效解决cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量低的问题，本发明在瞬转后采用分批补料培养的细胞培养方法，以此最快速得到最优的方式，同时相对于传统的转染方法，通过采用本发明的方法可以提高抗体表达量47.8％。

技术特征：

1.一种增强cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量的方法，其特征在于：其包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种增强cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量的方法，其特征在于：具体的细胞进行细胞复苏以及种子扩增为，传代培养基为balancd，传代培养中根据最终生产的培养规模逐步提高接种密度，传代过程中应保证细胞活率≥90％。

3.根据权利要求1所述的一种增强cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量的方法，其特征在于：种子细胞的培养参考设置，温度为37.0℃±0.5℃，co2浓度为5.0％，相对湿度为80％，摇床转速100rpm，摇床振幅为50mm。

4.根据权利要求1所述的一种增强cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量的方法，其特征在于：瞬转工艺，瞬转培养基为balancd，瞬转pei试剂为fectopro，转染时的细胞密度为2.0～4.0×106cells/ml，质粒用量为0.5μg/ml，pei:dna之间的比例为2。

5.根据权利要求1所述的一种增强cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量的方法，其特征在于：瞬转后的细胞培养工艺，瞬转初始培养温度为37℃，瞬转后24h降温至33℃继续培养，瞬转后开始取样检测细胞生长和生化参数，根据渗透压值灵活进行补料，结合补料中的含糖量，根据初始培养体积，添加400g/kg的葡萄糖母液至6.0g/l。

6.根据权利要求1所述的一种增强cho-k1细胞瞬转产生抗体表达量的方法，其特征在于：具体种子复苏与扩增包括细胞复苏与扩散阶段和n-1代阶段。

技术总结本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种增强CHO‑K1细胞瞬转产生抗体表达量的方法。其包括以下步骤：细胞提取以及转移，用液氮将CHO‑K1Q细胞株冻存管转移至水浴锅旁，将冻存管置于37.0℃±0.5℃水浴锅中静置解冻；对细胞进行细胞复苏以及种子扩增，将解冻后的细胞转移至已预热的培养基中进行传代扩增；瞬转，将以及复苏以及扩增的细胞内导入特定的质粒；分批补料培养，根据不同培养的情况进行灵活调整；通过生物分子分析仪进行分析，得到数据内容。本发明的有益之处：本技术方案通过PEI试剂进行瞬转及特定的细胞转染后培养方式，以有效解决CHO‑K1细胞瞬转产生抗体表达量低的问题，同时相对于传统的转染方法，通过采用本发明的方法可以提高抗体表达量47.8％。技术研发人员：宋佳睿,徐晓强,李亮,李皓受保护的技术使用者：泰澧生物技术（苏州）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/2