一种恶性胸腹水细胞体外液基三维培养和药敏测试的方法与流程

本发明涉及生物检测，涉及一种患者自身来源的培养体系，涉及高保真度的类体内样天然微环境和免疫细胞的培养系统，涉及一种肿瘤活性指标和代谢指标的药敏终点检测方法。

背景技术：

1、恶性胸腹水是中晚期癌症患者常见并发症，且给患者带来巨大痛苦，临床抽取胸腹水为常见缓解治疗方法，而抽取的胸腹水大多直接丢弃。中晚期癌症患者往往不适合手术治疗，没有组织样本来源可用于体外药敏检测，组织穿刺也往往不能满足体外药敏检测需求。胸腹水含有大量的脱落恶性细胞，是体外培养药敏检测理想的原材料。基于患者来源恶性胸腹水体外培养的药敏检测技术一般存在两个方面问题，培养基成分昂贵，使用具有伦理问题；体外二维培养不能准确反应其原始生物学特征而无法准确预测体内肿瘤对抗癌药物的反应；现有的三维培养必须基于固态的基质胶或者一定的培养支架，除了成较高且限制终点检测选择外，而且与体内液态环境不符。在抗癌药物体外药物反应检测中，普遍采用药物浓度梯度法测定量效反应，均无与体内反应对标的cutoff值，可评价性不足。此外，现有药敏检测计数缺乏耐药和敏感的阳性对照物，可靠性低，无法在临床预测药物反应中进行应用；而现有的一些耐药和敏感药物细胞株均为二维贴壁培养基础上二维药物反应体系所构建，形成三维培养物之后，反应性发生改变，大多丧失敏感性，无法运用于三维培养评价体系。耐药细胞大多是通过组织原代二维贴壁培养获得的。这种方法虽然简单易行，但是其获取的细胞多为无恶性胸腹水细胞。这意味着得到的细胞并不能代表所有的恶性胸腹水细胞。这些细胞通常处于腹水环境中，它们所处的液体环境是高蛋白和高炎症的，这与从实体组织中得到的细胞微环境存在明显的差异。与实体组织瘤来源的二维贴壁培养细胞相比，在原代二维贴壁培养中所得到的细胞的药物作用和反应原理有很大的不同。这是由于两种不同的细胞微环境导致的。在二维培养的过程中，细胞往往会出现强制脱落的现象，这会导致药物敏感性的下降，从而影响到我们对药物反应的研究。胸腹水培养与传统悬浮细胞培养药物反应动力学不同。传统悬浮培养对于浓度变化敏感，且未保留患者肿瘤微环境直接与药物接触，通过梯度药物浓度反应测量效曲线并且统一通过等效剂量进行评价，对于作用机制不同的药物评价参考性降低。胸腹水培养不止反应呈现不同的药物浓度模式、并且具有特殊的时间反应模式，且常常用于评价不同机制药物、药物联用方案，因此需要制定不同的药物反应体系。

2、因此，需要寻找一种更好的方法来解决这个问题。目前，正在尝试将二维贴壁培养转化为三维化培养，以期望能够得到更接近真实的恶性胸腹水细胞。然而，这个过程并不容易，可能会带来更多的困难，比如细胞活性的降低、药物敏感性的变化等。需要对这些问题进行全面的研究和分析，以找到最佳的解决方案。

3、基于上述问题限制了胸腹水药敏检测的实际临床应用。因此，临床不仅需要可以高度模拟体内微环境和生长方式的培养方法，并且需要成本及过程可控，操作方便的培养及药敏检测方法，并以三维培养阳性对照物作为质控，在通过前期临床一致性试验得出的药物浓度cutoff值作用下进行药物对组织的活性以及代谢的抑制反应测试，评价药物的敏感和耐药。

技术实现思路

1、本发明的目的在于为临床提供胸腹水三维培养药敏检测的方法。

2、本发明的技术方案：一种患者来源的恶性胸腹水细胞体外液基三维培养，基于含有相应患者自身胸腹水微环境的培养体系，恶性胸腹水细胞和部分淋巴细胞收集后使其在类体内样液基培养体系中进行空间增殖并自发形成具有一定三维结构的培养物，最后在与药物共培养条件下检测药物对三维培养物消耗葡萄糖代谢的影响和对细胞活性的影响。

3、进一步的，恶性胸腹水经过特定的方法分离获得：通过红细胞裂解，淋巴细胞分离液离心富集，磁珠去除过多淋巴细胞，最终富集获得原料细胞；也可以通过8-10μm滤膜过滤获得原料细胞。

4、进一步的，使用低吸附培养表面，将获取所述的原料细胞在患者自身来源的恶性胸腹水培养基中进行培养2-5天，模拟原始恶性胸腹水的营养微环境和悬浮生长状态，获得的种子三维培养物与原始细胞生物学特性一致性高，原料细胞中的淋巴细胞自组装到种子三维培养物中，反应原始恶性胸腹水所处的免疫微环境。

5、进一步的，所述获得的种子三维培养物在上述培养基中经过与待测药物及药物组合共培养。培养方法进一步包括：保存液配方包括，含有5％胎牛血清的hank's平衡液，含0.01％聚乙二醇，0.1％还原型谷胱甘肽，100u/ml青霉素，0.1mg/ml硫酸链霉素，0.25μg/ml两性霉素b，0.01μg/ml阿奇霉素，0.1μg/ml氢化可的松，1μg/ml抗坏血酸，0.2mm 2-巯基乙醇，适用于运输环境，遵循保存方法，在72h的保存时间限度以内，有效延缓细胞离体后活性降低。

6、所述方法的培养基还考虑到了以下几个方面：

7、①通过保护并维护细胞的三维结构防止其崩解，其中包括对细胞外基质(ecm)的三维支架进行保护，这可以有效防止主要成分如透明质酸、胶原蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白被破坏。同时，它也添加了基质金属酶抑制剂如多西环素1μg/ml，蛋白酶抑制剂如bestatin2μg/ml，以保护细胞间的连接和细胞与ecm之间的连接。此外，它还添加了氯化钙350μg/ml和左旋糖酐铁10μg/ml，以及抗氧化剂如β-巯基乙醇10μg/ml和维生素e 5μg/ml，这些都是为了提高培养基的稳定性。

8、②其次，该培养基能有效保护和维持微环境的组成，包括多种类型的肿瘤细胞、肿瘤相关的成纤维细胞、免疫细胞等。这样能保证化疗药物、靶向药物、免疫药物(免疫细胞与肿瘤细胞互作)等大部分肿瘤临床治疗药物及其联合方案的有效使用。

9、③最后，这个培养基能有效减少液体的剪应力刺激，减低细胞在培养板上吸附的可能性，从而增加了细胞从培养板上脱离的难度。同时，培养基中还加入了高分子量的聚(乙二醇)二丙烯酸酯5μg/ml，去乙酰化结冷胶5μg/ml，海藻酸钠5μg/ml，这些物质都能提高培养基的抗组织崩解能力。

10、进一步的，本技术还提供了一种三维培养物对药物作用的反应通过检测细胞活性以及葡萄糖代谢进行检测并且评价抑制率。

11、进一步的，本技术还提供了一种提供能够抵抗药物和具备敏感性的标准样本。建立胸水细胞株的模型方法，将肺癌细胞进行逆转录病毒转染，并在裸小鼠的胸腔中接种。在60天之后，会收集pbs胸腔灌洗液，然后使用流式细胞仪对其中带有rfp标记的脱落细胞进行二次接种。这些耐药建模组的细胞会在接种7天后接受顺铂治疗，剂量为5mg/kg/周，而对照组则会接受等量的pbs。在90天之后，会再次收集pbs胸腔灌洗液，并使用流式细胞仪分离出顺铂耐药和敏感的胸水细胞株r和s。这些细胞株将被以1×105cell/管的形式储存在液氮中以备将来使用。

12、在复苏方法方面，取出一个冻存的细胞管，然后在37℃的水浴中迅速溶解，接着在700rpm下以2分钟的速度进行离心，最后丢弃冻存液，并将5ml 10％fbs的rpmi1640培养基用于重悬低吸附60mm培养皿。然后我们在37℃的5％co2培养箱中培养过夜来进行复苏。

13、对于药敏检测，我们首先用1000ml的吸头轻轻吹打细胞，然后将其以200μl/孔的形式接种到低吸附96孔板中，并在每个孔中加入顺铂10、20μg/ml、顺铂10μg/ml+培美曲塞10μg/ml，然后在继续培养72小时后进行终点检测同样地，将直肠癌细胞colo205进行绿色荧光蛋白gfp的逆转录病毒转染，并在裸小鼠的腹腔中进行接种。在90天之后，收集腹水，并用流式细胞仪对其中的gfp标记的脱落细胞进行二次接种。在耐药建模组的细胞接受了90天的顺铂治疗后，我们会收集腹水，并在流式细胞仪的分选下获得了顺铂耐药和敏感的腹水细胞株colo205s和colo205r。这些细胞株也会被以1×105cell/管的形式储存在液氮中以备将来使用

14、最后，取出一冻存管，在37℃的水浴中快速溶解，然后在700rpm下以2分钟的速度进行离心，并丢弃冻存液。我们会使用5ml 10％fbs的rpmi1640培养基来重新悬浮细胞，并在37℃的5％co2培养箱中培养过夜来进行复苏。

15、药敏检测的过程是先用1000ml的吸头轻轻吹打细胞，然后将其以200μl/孔的形式接种到低吸附96孔板中，并在每个孔中加入顺铂5、10、20μg/ml，然后继续培养72小时后进行终点检测。

16、进一步的，本技术还提供了一种量效曲线测定的方法，根据患者的药物反应情况确定最佳检测浓度(cutoff值)。已经确定了顺铂的检测cutoff值。具体来说，可以通过绘制药物浓度反应曲线，然后利用体内模型或患者药物反应率计算出临床一致的浓度(cutoff值)，最后得出顺铂在细胞中的药敏体外cutoff值为10μg/ml的结果。

17、进一步的，待测药物包含化疗药、靶向药、免疫药其他化合物分子。种子三维培养物经过胰酶消化，可进行扩充培养，获得其他临床应用或者科学研究所需的细胞数量。

18、本发明取得的技术效果为：

19、解决了传统体外培养存在的许多问题，如细胞因子和基质胶的依赖、药敏检测对大量细胞的需求和对三维培养的需求等。通过模拟体内的液基培养环境，结合患者的药物反应情况，可以更真实地反映药物对恶性胸腹水细胞的影响，从而为临床治疗提供更准确的预测。此外，这种方法还解决了三维培养对细胞因子和基质胶的限制，降低了成本，提高了临床检测的实际操作可能性。同时，由于药敏结果具有高度临床符合性，因此可以为医生提供更准确的治疗建议。