一种检测水稻TT2基因型的KASP引物组、试剂盒及其应用

本发明涉及作物遗传育种，尤其涉及一种检测水稻tt2基因型的kasp引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、水稻作为全世界最重要的粮食作物之一，全球约有一半的人口以水稻作为主食，而在亚洲以之为主食的人口占比则更大。目前的水稻种植区大部分区域地处高温伏旱区，抽穗开花期常遭遇高温天气，对水稻的结实及产量造成了极大的影响，会造成水稻秕粒率增加、籽粒充实度下降、产量降低、米质变劣，给水稻生产造成严重损失。因此，开展水稻耐高温种质资源的筛选和水稻品种的耐高温性精准鉴定，以推动水稻耐高温性育种进程，保障粮食安全已成为当前水稻研究的一个重要课题。

2、水稻耐高温性是受多种遗传因素和环境共同调控的数量性状。利用耐高温基因连锁分子标记在水稻苗期从dna水平对目标植株进行高温耐性选择，可以弥补传统育种中出现的诸多弊端，是提高耐高温水稻育种效率的有效途径。目前，水稻部分耐高温基因已被克隆且存在功能变异，如tt2(基因编号loc9269602)。tt2编码区存在snp位点，其中16733442bp处存在c/a的变化，引起耐高温性差异。依据该单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,snp)可将核心种质材料tt2分作两种单倍型，二者存在极显著的耐高温性差异。利用导致基因功能变异的碱基位点开发标记，筛选水稻种质中的有利等位变异，为培育水稻耐高温品种具有重要意义。然而，传统的连锁标记主要是基于与基因连锁的分子标记进行基因型鉴定，不能用来准确鉴定材料目标性状有利基因单倍型组合以及进行定向的改良育种，并且操作复杂、通量小、劳动力消耗量大。因此，开发水稻重要耐高温基因新标记，利用基因标记辅助选择耐高温性较好的目标单株，可以大大提高选择效率，加快育种进程。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，开发针对水稻耐高温基因tt2 snp位点的kasp引物组，确定了有利基因型，能够应用于耐高温水稻种质的筛选、鉴定以及应用于基因型辅助改良水稻耐热性。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种检测水稻tt2基因型的kasp引物组，所述引物组包括第一正向引物、第二正向引物和反向引物；

4、所述第一正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述第二正向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示。

5、优选地，所述引物组针对水稻耐高温基因tt2的snp位点，所述snp位点位于3号染色体的16733442bp处，碱基为a或c。

6、优选地，所述第一正向引物和第二正向引物采用不同标记物修饰。

7、优选地，所述标记物为荧光基团或标签序列。

8、优选地，所述第一正向引物采用fam标签序列修饰；第二正向引物采用hex标签序列修饰。

9、第二方面，本发明提供了一种检测水稻tt2基因型的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组和2×kasp mastermix。

10、第三方面，本发明提供了一种检测水稻耐高温基因tt2基因型的方法，包括如下步骤：

11、(1)提取待检测水稻的基因组dna；

12、(2)采用上述引物组或上述试剂盒对所述基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

13、(3)对所述pcr扩增产物进行标记物检测，获得对应的基因型。

14、优选地，所述pcr扩增的反应体系为：模板dna 0.8μl，2×kasp master mix 0.75μl，引物混合液0.05μl，总体积1.6μl；

15、所述引物混合液中，第一正向引物、第二正向引物和反向引物的浓度均为100μm。

16、优选地，所述pcr扩增的反应程序为：94℃15min；94℃20s；61℃～55℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，26个循环。

17、第四方面，本发明提供了一种上述引物组或上述试剂盒在如下a1～a4任一种中的应用：

18、a1.鉴定或辅助鉴定水稻高温耐性；

19、a2.制备用于鉴定或辅助鉴定耐高温水稻的产品；

20、a3.耐高温水稻辅助育种；

21、a4.制备用于耐高温水稻辅助育种的产品。

22、本发明提供了一种检测水稻tt2基因型的kasp引物组、试剂盒及其应用。本发明针对水稻耐高温基因tt2(loc9269602)中snp位点设计引物组，通过筛选，去除了引物组合出现的错配、发夹结构、引物二聚体等情况，获得的3条引物可有效区分等位变异位点。通过37份水稻种质材料验证，本发明的引物组能够快速、准确的鉴定水稻tt2基因的基因型，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，为耐高温水稻辅助育种提供了新思路。

技术特征：

1.一种检测水稻tt2基因型的kasp引物组，其特征在于，所述引物组包括第一正向引物、第二正向引物和反向引物；

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组针对水稻耐高温基因tt2的snp位点，所述snp位点位于水稻3号染色体的16733442bp处，碱基为a或c。

3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一正向引物和第二正向引物采用不同标记物修饰。

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述标记物为荧光基团或标签序列。

5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述第一正向引物采用fam标签序列修饰；第二正向引物采用hex标签序列修饰。

6.一种检测水稻tt2基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的引物组和2×kasp mastermix。

7.一种检测水稻耐高温基因tt2基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为：模板dna 0.8μl，2×kasp mastermix 0.75μl，引物混合液0.05μl，总体积1.6μl；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应程序为：94℃15min；94℃20s；61℃～55℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，26个循环。

10.一种权利要求1～5任一项所述的引物组或权利要求6所述的试剂盒在如下a1～a4任一种中的应用：

技术总结本发明提供了一种检测水稻TT2基因型的KASP引物组、试剂盒及其应用，属于作物遗传育种技术领域。本发明的引物组包括第一正向引物、第二正向引物和反向引物。本发明针对水稻耐高温基因TT2的SNP差异位点(位于水稻3号染色体的16733442bp处)，设计出特异性引物组进行基因型鉴定，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测水稻耐高温基因TT2，能够应用于耐高温水稻种质的筛选、鉴定以及应用于基因型辅助改良水稻耐热性，对促进耐高温水稻育种具有重要意义。技术研发人员：巫明明,傅艺炜,张小明,吴佳椰露,叶胜海,翟荣荣,朱国富,叶靖受保护的技术使用者：浙江省农业科学院技术研发日：技术公布日：2024/9/2