动脉粥样硬化斑块样本单细胞核悬液的制备方法及应用

本发明涉及生物检测，尤其涉及一种动脉粥样硬化斑块样本单细胞核悬液的制备方法及应用。

背景技术：

1、动脉粥样硬化是一种影响血管健康的常见疾病，其特征是在血管壁内形成斑块，主要由胆固醇、钙和其他物质组成。在当前医学研究中，对动脉粥样硬化斑块的深入理解对于预防和治疗心血管疾病至关重要。

2、传统上，研究者们主要关注整体组织水平的分析，这种方法限制了对单个细胞层面的深入研究。然而由于斑块样本坏死区域广泛、杂质多、样本活性差，存在钙化区域和脂质坏死核心，对于分离单个活细胞存在较大难度并且得率低，单细胞测序的结果也容易出现因分离造成的偏倚。

3、cn111549019a公开了一种显著提升单细胞悬液质量的动脉斑块消化的方法，但因为动脉粥样硬化斑块样本坏死广泛，该方法所得活细胞较少且细胞类型不全面，因此并不适合应用于单细胞测序等下游分析。

4、cn113293196a虽然公开了一种适用于冷冻组织的单细胞核提取方法，然而其分离液组分较简单，只考虑到对rna的保护作用，限制了所得单细胞核悬液在其他单细胞多组学研究中的应用，并且其差速离心程序不适用于组成复杂、杂质较多的样本，特别是动脉粥样硬化斑块样本。

技术实现思路

1、鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了动脉粥样硬化斑块样本单细胞核悬液的制备方法及应用，本发明得到的单细胞核，能够较全面的获取各种类型的细胞，同时减少了核酸、蛋白等物质的破坏，为高分辨率的单细胞测序提供了高还原度的样本基础。本发明的分离方法简单、无特殊设备需求、样本适用性好，使得研究者能够在细胞水平上进行更为精细和准确的分析。

2、本发明要解决的问题是利用简单、便捷的方法分离动脉粥样硬化斑块样本的单细胞核。

3、为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

4、一种用于制备动脉粥样硬化斑块样本单细胞核悬液的消化体系，包括ca-630、匀浆缓冲液；

5、所述匀浆缓冲液包括tris缓冲液、无机盐、糖、二硫苏糖醇(dtt)，酶抑制剂。

6、所述无机盐包括氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、氯化镁(mgcl2)、氯化钙(cacl2)中的至少一种；

7、所述糖包括蔗糖、葡萄糖、果糖中的至少一种。

8、所述酶抑制剂包括rna酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的至少一种。

9、所述匀浆缓冲液还包括无酶水。

10、消化体系中，ca-630的体积浓度为0.2％-0.3％；余量为匀浆缓冲液。

11、作为本发明的一个实施方式，所述匀浆缓冲液包括tris缓冲液(ph 7.4-8.0)、氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、氯化镁(mgcl2)、氯化钙(cacl2)、蔗糖、rna酶抑制剂、二硫苏糖醇(dtt)、蛋白酶抑制剂混合液、磷酸酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和无酶水。

12、进一步地，消化体系中，所述tris缓冲液的浓度为15-20mm，nacl的浓度为15-20mm，kcl的浓度为60-80mm，mgcl2的浓度为5-10mm，cacl2的浓度为1-2mm，蔗糖浓度为250-300mm，rna酶抑制剂的浓度为0.5-2u/ml，dtt的浓度为0.5-2mm，蛋白酶抑制剂混合液的添加量为10-30μl/ml，磷酸酶抑制剂的浓度为0.01-0.1μm，组蛋白去乙酰化酶抑制剂的浓度为10-30mm。

13、所述tris缓冲液包括tris-hcl。

14、本发明还提供了一种动脉粥样硬化斑块组织的单细胞核悬液的制备方法，包括以下步骤：

15、步骤1、研磨样本，并在如上所述的消化体系中消化；

16、步骤2、步骤1中消化后的混合液过滤，收集滤液a,并用细胞核重悬液冲洗滤膜，收集滤液b，将滤液a和滤液合并离心，收集沉淀；

17、步骤3、用匀浆缓冲液、细胞核重悬液分别对步骤2沉淀进行梯度离心，制得所述动脉粥样硬化斑块组织的单细胞核悬液。

18、消化体系包括ca-630、匀浆缓冲液；

19、所述匀浆缓冲液包括tris缓冲液、无机盐、糖、二硫苏糖醇(dtt)，酶抑制剂。

20、所述无机盐包括氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、氯化镁(mgcl2)、氯化钙(cacl2)中的至少一种；

21、所述糖包括蔗糖、葡萄糖、果糖中的至少一种。

22、所述酶抑制剂包括rna酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的至少一种。

23、所述匀浆缓冲液还包括无酶水。

24、消化体系中，ca-630的体积浓度为0.2％-0.3％；余量为匀浆缓冲液。

25、作为本发明的一个实施方式，所述匀浆缓冲液包括tris缓冲液(ph 7.4-8.0)、氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、氯化镁(mgcl2)、氯化钙(cacl2)、蔗糖、rna酶抑制剂、二硫苏糖醇(dtt)、蛋白酶抑制剂混合液、磷酸酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和无酶水。

26、进一步地，消化体系中，所述tris缓冲液的浓度为15-20mm，nacl的浓度为15-20mm，kcl的浓度为60-80mm，mgcl2的浓度为5-10mm，cacl2的浓度为1-2mm，蔗糖浓度为250-300mm，rna酶抑制剂的浓度为0.5-2u/ml，dtt的浓度为0.5-2mm，蛋白酶抑制剂混合液的添加量为10-30μl/ml，磷酸酶抑制剂的浓度为0.01-0.1μm，组蛋白去乙酰化酶抑制剂的浓度为10-30mm。

27、所述tris缓冲液包括tris-hcl。

28、步骤3具体如下：

29、步骤3.1、将步骤2的沉淀采用匀浆缓冲液重悬，于300-500g，4-8℃，离心5-10min，回收细胞核沉淀a；

30、步骤3.2、细胞核沉淀a重悬于细胞核重悬液，于200-500g，4-8℃，离心5-10min，去除碎片杂质，保留细胞核沉淀b；

31、步骤3.3、细胞核沉淀b重悬于细胞核重悬液，于30-50g，4-8℃，离心10-20s，去除大块杂质，保留上清液；

32、步骤3.4、步骤3.3的上清液补充细胞核重悬液，于300-500g，4-8℃，离心5-10min，去除脂质杂质，得细胞核沉淀c；将细胞核沉淀c重悬于细胞核重悬液中，得所述动脉粥样硬化斑块组织的单细胞核悬液。

33、细胞核重悬液包括含有0.5-2mm dtt的pbs。

34、所述样本包括鲜动脉粥样硬化斑块组织或冻存动脉粥样硬化斑块组织。

35、步骤1中，所述样本与消化体系的用量比为50mg：0.5-1ml。

36、步骤1中，消化条件：温度2-8℃；时间10-15min。

37、步骤1中，磨碎样本前，冻存斑块样本修剪，去除钙化块并用无酶水冲洗2-3次。

38、步骤1中，消化具体步骤如下：

39、样本用无酶水冲洗，添加部分消化体系浸泡2-5min，破碎至1-2mm3的小块；研磨样本，添加剩余消化体系，在2-8℃消化裂解10-15min。

40、本发明提供的匀浆缓冲液，使用了多种酶的抑制剂，能够对细胞核起到有效保护，防止生物活性物质的降解和变性，有利于在高分辨率的单细胞多组学分析中的应用。ca630是一种非离子表面活性剂，能够破坏细胞膜，从而将细胞核释放出来，同时对于斑块样本富含的脂质也有溶解去除作用。rna酶抑制剂可以防止rna的降解，保护细胞核中的rna完整性；二硫苏糖醇是一种还原剂，有助于保持蛋白质的天然构象，防止蛋白质的氧化和聚集，从而保护细胞核中的蛋白质结构完整性；蛋白酶抑制剂的加入可以防止蛋白质的降解，对于保留蛋白质的活性和结构非常重要；磷酸酶抑制剂可以防止内源性蛋白酶、磷酸酶对细胞核蛋白的降解和去修饰，磷酸酶抑制剂的加入可以保持蛋白原有的磷酸化状态；组蛋白去乙酰化酶抑制剂也能够防止蛋白降解和去修饰，使组蛋白保持乙酰化状态，这有利于保持染色质结构的稳定性。这些酶抑制剂的使用，可以从dna、rna、蛋白以及表观修饰等角度保证细胞核的完整性和稳定性，为后续的单细胞多组学分析提供了可靠的基础。

41、本发明提供的单细胞核悬液制备方法的优势之处在于通过梯度离心对不同漂浮密度的杂质进行去除。通过不同离心速度去除碎片杂质，对于处理动脉粥样硬化斑块为代表的复杂样本具有重要意义。

42、本发明还提供了一种动脉粥样硬化斑块单细胞核悬液在试剂盒制备，以及单细胞测序中的应用。

43、在本发明的较佳实施方式中，详细说明了制备动脉粥样硬化斑块单细胞核悬液的方法。

44、在本发明的对比例中，使用了常规冷冻样本单细胞核提取方法，作为实施例的对比方式来说明实施例的技术效果显著。

45、本发明的有益技术效果如下：

46、1、本发明的关键之处在于：动脉粥样硬化斑块可能包含多种细胞类型和细胞外基质，这使得制备单细胞悬液变得复杂；而冷冻的动脉粥样硬化斑块由于保存时间延长，使得在制备过程中保持细胞核的得率和高还原度成为挑战。为了提高细胞活性，本发明通过在匀浆缓冲液中添加ca-630和多种酶抑制剂，有效地实现了对细胞核的分离和保护，得到细胞类型丰富的单细胞核悬液。

47、2.本发明不仅适用于新鲜斑块样本，还适用于冷冻保存的样本，具有更强的兼容性。

48、3.本发明获得的单细胞核悬液更为纯净，且具有高还原度的特点。通过实际对比相关专利，本发明较cn108865975a、cn113293196a方法能够获得更纯净、更高生物活性的单细胞核悬液；多种酶抑制剂保证了悬液中的细胞核能够保持其原始状态，减少核酸、蛋白、染色质结构、修饰状态等所受的损伤、污染或改变，从而确保后续实验或分析的结果准确可靠；梯度离心的分离方法能够便捷的将大部分杂质去除，提高了单细胞核样本的纯度。

49、4.本发明的制备方法不仅简单方便，而且无需高度专业化的设备、试剂或技能。这使得研究人员能够轻松进行操作，具有显著的实际应用价值。

50、本发明通过ca-630和匀浆缓冲液配置的消化液对斑块组织样本进行消化解离处理，再经匀浆缓冲液和细胞核重悬液进行梯度离心以去除钙化碎片等杂质，从而得分离度高的高质量单细胞核悬液。本发明的单细胞核悬液得率高、纯度好、细胞类型丰富，充分还原病理及生理状态下的细胞类型及比例，为鲜离体的、以及已冻存的样本组织提供如单细胞测序、流式分析等多种研究的基础，大大提高了样本库的利用度。