基于CRISPR/Cas系统的真菌检测试剂、试剂盒及检测方法

本发明属于真菌病原体检测，具体涉及一种基于crispr/cas系统的真菌检测试剂、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、真菌是引起人类感染的主要病原体之一。全球每年约有300万人发生慢性重度真菌感染，近190万例患者会发展为急性侵袭性真菌感染，每年至少有160万例患者因真菌感染而失去生命，与感染疟疾和结核杆菌死亡的例数相当。目前人类认识的真菌菌种超过12万，其中与人类感染相关的大约有400种。酵母菌相关感染的发病率和死亡率均居真菌感染首位，平均死亡率为15％～35％，发展中国家的死亡率可达40％。有研究结果显示，侵袭性真菌病(ifds)死亡患者的早期诊断率仅为12％～60％，未能准确诊断和积极治疗是ifds致死率高的主要因素。此外，有研究结果显示，除去确诊前的检测和治疗费用，美国因真菌感染性疾病住院的直接医疗总费用为46亿美元，念珠菌属感染和曲霉菌感染分别占30.43％和26.09％；而且，由于大多真菌感染性疾病不能被有效诊断，可能导致用于治疗侵袭性真菌感染的医疗成本被低估。因此，快速、准确地识别真菌病原体对疾病有效治疗、改善疾病预后以及降低社会医疗负担都十分重要。

2、目前常见的检测方法包括：真菌形态学检测、显色培养、生化鉴定、质谱鉴定、抗原抗体检测、核酸检测等技术手段。传统的真菌诊断如真菌培养分离、显微检查技术等，虽可提供菌种鉴定和体外药物敏感性试验数据，有效地指导临床精准治疗，但是培养敏感性低、周期长，而pcr(聚合酶链反应)检测的靶标为病原微生物的核酸，诊断灵敏度高、特异性强、检测时间短，弥补了临床少见、难培养病原体诊断。

3、pcr技术虽然在过去几十年里取得了显著的进步，但在面临真菌检测时仍面临若干关键局限性：1)特异性和灵敏度的平衡：pcr方法在设计特异性引物时需要在灵敏度和特异性之间取得平衡。特别是对于种属相近的真菌，高特异性的引物设计可能导致检测灵敏度降低。2)交叉反应：在真菌多样性丰富的样本中，可能出现引物与非目标dna发生交叉反应，这会导致假阳性结果。3)操作复杂性和成本：pcr技术通常需要专业的实验室设备和技术专长。此外，高通量的真菌检测需要昂贵的实验材料和设备，这在资源有限的环境中尤其成问题。4)检测效率：尽管pcr技术相比传统培养方法有所提速，但从样本准备到结果输出仍需数小时甚至更长时间，对于需要快速响应的场合不够理想。特别pcr往往只能针对具体的种和属做设计，很难做到对十余种或更多真菌的同时检测。

4、基于高通量测序技术的真菌检测方法：测序技术在真菌检测方面的主要优势是其能提供极高的准确性和分辨率，使得对各种真菌的鉴定更为精确，尤其对于那些形态学上难以区分的真菌种。然而高通量测序仍然有较大局限性，包括1)高成本：高通量测序技术虽然能提供详细的真菌群落信息，但这种方法成本高昂，可能不适用于常规检测或资源有限的环境。2)复杂的数据分析：测序产生的数据量大，需要复杂的生物信息学分析，这不仅增加了时间成本，也要求有相应的专业知识和技术支持。3)样本准备和污染问题：测序技术对样本质量有较高要求，且在样本准备过程中易受到环境污染的影响，这可能导致数据的不准确。

5、crispr/cas系统已被广泛应用于基因编辑和体外诊断。自2016张峰团队发现cas13具有可切割任意非特异rna至今，已有sherlock、detecter等临床即检试剂用于病毒等检验，具有快速、灵敏性及特异性高等特点。后续2018年我国王金教授等团队也发表了相关诊断技术的论文。目前crispr/cas体外诊断需与核酸扩增相结合，以提高敏感性，达到临床需求。其中恒温扩增技术因使用操作及仪器简单，可实现临床即检，受到研究者青睐。主要包括重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)，但rpa需要的专用酶混合物较难获得；lamp引物设计要求高，因此在技术实施、临床实践落地等方面存在困难。多重pcr是目前实验室常见检测技术，在引物设计及实验操作方面更加简易。此外目前crispr-cas系统用于真菌诊断的技术尚无报道。

技术实现思路

1、针对上述挑战，本发明提出了一种结合内转录间隔区(its)序列分析和crispr/cas12a系统的创新真菌检测方法。its序列因其在不同真菌间的高度变异性，被认为是真菌鉴定的“金标准”。然而，单纯的its序列分析在某些情况下可能不足以快速准确地区分近缘真菌种。因此，本发明通过引入crispr/cas12a系统，利用其对rna指导的dna识别和切割能力，提高了对特定真菌种的检测特异性和灵敏度。crispr/cas12a系统的引入，不仅允许对真菌进行更加精确的鉴定，相比qpcr本发明支持较高通量的真菌检测，同时节省实验材料尤其是核酸样本，另外相比高通量测序技术还显著缩短了检测时间，降低了操作复杂性。

2、本发明包括如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种sgrna，所述sgrna用于基于crispr/cas系统的真菌病原体检测，所述sgrna包括向导序列片段和锚定序列，所述向导序列片段是与真菌病原体its区域互补配对的特异性序列，所述sgrna的向导序列片段的核苷酸序列如seq idno.13-25所示，所述锚定序列片段为uaauuucuacuaaguguagau。

4、所述的真菌病原体选自烟曲霉、隐球菌、耶氏肺孢子菌、黑曲霉、土曲霉、印度毛霉、卷枝毛霉、不规则毛霉、总状毛霉、粗球孢子菌属、多育赛多孢、茄病镰刀菌、构巢曲霉中的一种或两种以上的组合。

5、在本发明的优选实施方式中，针对上述真菌病原体的sgrna序列为seq id no.26-38所示的核苷酸序列的组合。

6、第二方面，本发明提供一种引物对，所述引物对用于特异性扩增真菌病原体its区域。

7、所述的真菌病原体选自烟曲霉、隐球菌、耶氏肺孢子菌、黑曲霉、土曲霉、印度毛霉、卷枝毛霉、不规则毛霉、总状毛霉、粗球孢子菌属、多育赛多孢、茄病镰刀菌、构巢曲霉中的一种或两种以上的组合。

8、在本发明的优选实施方式中，针对烟曲霉、隐球菌、耶氏肺孢子菌、黑曲霉、土曲霉、印度毛霉、卷枝毛霉、不规则毛霉、总状毛霉的特异性引物对如seq id no.1-2所示；针对粗球孢子菌属的特异性引物对如seq id no.5-6所示；针对多育赛多孢的特异性引物对如seq id no.7-8所示；针对茄病镰刀菌的特异性引物对如seq id no.9-10所示；针对构巢曲霉的特异性引物对如seq id no.11-12所示。

9、第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括crispr/cas12a系统，所述crispr/cas12a系统包括本发明第一方面所述的sgrna。

10、优选的，所述试剂盒中sgrna序列为seq id no.26-38所示的核苷酸序列的组合。

11、进一步，所述crispr/cas12a系统还包括cas12a蛋白和荧光报告探针，所述cas12a蛋白是一种在单链sgrna引导下与靶dna特定位点结合并切割的核酸内切酶，所述荧光报告探针为一段序列富含t的单链dna，其5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。本领域技术人员可基于常规技术手段合成或者委托第三方合成得到所述荧光报告探针，无需付出创造性劳动。

12、所述荧光报告基团选自fam、vic、hex、rox、joe、cy3、cy5中的一种，所述荧光淬灭基团选自tamra、bhq-1、bhq-2、bhq-3中的一种。

13、进一步，所述试剂盒还包括pcr扩增体系，所述pcr扩增体系中包括特异性扩增真菌病原体its区域的引物对。

14、优选的，针对烟曲霉、隐球菌、耶氏肺孢子菌、黑曲霉、土曲霉、印度毛霉、卷枝毛霉、不规则毛霉、总状毛霉的特异性引物对如seq id no.1-2所示；针对粗球孢子菌属的特异性引物对如seq id no.5-6所示；针对多育赛多孢的特异性引物对如seq id no.7-8所示；针对茄病镰刀菌的特异性引物对如seq id no.9-10所示；针对构巢曲霉的特异性引物对如seq id no.11-12所示。

15、根据本发明的具体实施例，所述试剂盒还包括基于pcr扩增和crispr/cas12a系统检测所需的其他常规试剂、阳性对照品和阴性对照品。

16、具体的，所述pcr扩增常规试剂包括但不限于dna聚合酶、扩增缓冲液、dntp；crispr/cas12a系统检测的常规试剂包括但不限于rna reporter、缓冲液、rnaseinhibitor、ddh2o。

17、第四方面，本发明提供一种非疾病诊断目的的检测真菌病原体的方法，所述方法包括如下步骤：

18、(1)提取待检样品的基因组dna；

19、(2)以所述基因组dna为模版，本发明第二方面提供的引物对进行pcr扩增；

20、(3)将pcr扩增产物加入到本发明提供的crispr/cas12a系统进行检测，根据荧光强度判断检测结果。

21、第五方面，本发明提供一种本发明第一方面所述的sgrna、本发明第二方面所述的引物对和本发明第三方面所述的试剂盒在制备检测真菌病原体产品中的用途。

22、所述的真菌病原体选自烟曲霉、隐球菌、耶氏肺孢子菌、黑曲霉、土曲霉、印度毛霉、卷枝毛霉、不规则毛霉、总状毛霉、粗球孢子菌属、多育赛多孢、茄病镰刀菌、构巢曲霉中的一种或两种以上的组合。

23、本发明提供的真菌病原体检测方法的原理为：首先，通过pcr技术针对性地扩增目标真菌的its序列，这一区域因其在不同真菌种类中的高度变异而被广泛用于真菌鉴定。随后，利用crispr/cas12a系统的高度特异性，通过设计针对目标真菌its序列的特异性单向rna(sgrna)，实现对特定真菌种类的精准检测。当cas12a检测到与其sgrna互补的its序列时，会激活其核酸内切酶活性，从而引发一系列可检测的信号，如荧光发射，实现对真菌的有效识别。

24、本发明将真菌内转录间隔区(its)序列和crispr-cas12系统结合，提供一种快速、高灵敏度和高特异性的真菌识别和检测手段。相比于目前的荧光定量pcr，本发明不需要特别精密的荧光定量pcr仪器，就可实现对常见真菌的定性检测，经过pcr-crispr的两级信号放大，同时提高了灵敏度和特异性。本发明提供的方法操作简单、成本低、时间短、灵敏度高，对真菌的临床诊断具有重大的指导意义。