具有路易斯X骨架的低聚糖的制造方法与流程

本发明涉及具有路易斯x骨架的低聚糖的制造方法。

背景技术：

1、人母乳中所含的低聚糖(hmo)作为益生元材料受到关注，婴幼儿认知功能发育、抵御感染、肠道环境的改善等效果已被公开(非专利文献1)。

2、作为具有路易斯x骨架的低聚糖的一种，已知乳糖-n-岩藻五糖iii(以下称为lnfpiii)、乳糖-n-新双岩藻基六糖ii(lnndfhii)等。其中，lnfpiii为在乳糖-n-新四糖(以下称为lnnt)的n-乙酰葡糖胺3位以α1,3-键结合有岩藻糖的五糖hmo。

3、lnfpiii在人母乳中大量含有，仅次于同样为五糖且已知为lnfpiii的异构体的乳糖-n-岩藻五糖i(以下称为lnfpi)、乳糖-n-岩藻五糖ii(以下称为lnfpii)等(非专利文献2)。

4、lnfpiii被认为具有巨噬细胞和nk细胞的活化作用、作为细胞因子的一种的il-10和tnfα的分泌诱导作用(非专利文献3)，其功能性受到关注。

5、作为以lnfpiii为代表的具有路易斯x骨架的低聚糖的制造方法，已知有使用α1,3-岩藻糖转移酶的酶反应法、微生物发酵法。作为α1,3-岩藻糖转移酶，已知有例如来自helicobacter pylori(幽门螺杆菌)的fuctiii(非专利文献4)、来自bacteroidesfragilis(脆弱拟杆菌)的bf13ft(非专利文献5)。

6、另外，非专利文献6中公开了通过使用过表达来自幽门螺杆菌的α1,3-岩藻糖转移酶、futa或futb的大肠杆菌的发酵法来生产lnfpiii的方法。

7、现有技术文献

8、非专利文献

9、非专利文献1：int j pediatrics(2019)2390240：1-8

10、非专利文献2：nutrients(2019)11，1282

11、非专利文献3：journal of functional foods 72(2020)104074

12、非专利文献4：acs catal. (2019)9，10712-10720

13、非专利文献5：acs catal. (2019)9，12，11794-11800

14、非专利文献6：biotechnol.prog. (2004)20，412-419

15、非专利文献7：metabolic engineering 41(2017)23-38

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、如上所述，作为具有路易斯x骨架的低聚糖的制造方法，已知有使用α1,3-岩藻糖转移酶的酶反应法、微生物发酵法。但是，非专利文献4、5和6等中记载的公知的α1,3-岩藻糖转移酶的底物特异性低，因此存在如下问题：例如，在lnfpiii的生产中，产生作为副产物的在lnnt的还原末端侧葡萄糖3位结合有岩藻糖的乳糖-n-岩藻五糖vi(以下称为lnfpvi)、乳糖-n-新双岩藻基六糖ii(以下称为lnndfhii)。

3、另外，非专利文献6中记载的来自幽门螺杆菌的α1,3-岩藻糖转移酶不仅可使用lnnt、而且可使用乳糖作为底物，因而会生成作为副产物的3-岩藻糖基乳糖(以下称为3fl)(非专利文献7)，因此不适合于以乳糖为起始原料的lnfpiii的生产。

4、为了更高效地制造lnfpiii等具有路易斯x骨架的低聚糖，需要探索能够向lnnt等底物的n-乙酰葡糖胺部位选择性地转移岩藻糖的α1,3-岩藻糖转移酶。

5、因此，本发明的目的在于，提供具有路易斯x骨架的低聚糖的生产率优良的微生物、特别是具有lnfpiii骨架的低聚糖的生产率优良的微生物。

6、用于解决问题的方法

7、本发明人发现，增强了戈氏副拟杆菌(parabacteroides goldsteinii)jcm 13446的gdp-岩藻糖基转移酶1(以下称为fuct1)、革兰氏菌属(gramella sp.)bom4的fuct-d、副拟杆菌属(parabacteroides sp.)bx2的fuct-a或毛螺菌科细菌(lachnospiraceaebacterium)nlae-zl-g231的fuct-e的活性的微生物与亲株相比具有路易斯x骨架的低聚糖的生产率提高，从而完成了本发明。

8、即，本发明如下所述。

9、1. 一种微生物，其中，下述[1]～[6]中任一项记载的蛋白质的活性得到增强、并且与亲株相比具有路易斯x骨架的低聚糖的生产率提高。

10、[1]由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质。

11、[2]由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有α1,3-岩藻糖基转移酶活性的突变蛋白。

12、[3]由与序列号2所示的氨基酸序列具有90%以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有α1,3-岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白。

13、[4]由序列号24所示的氨基酸序列构成的蛋白质。

14、[5]由序列号18所示的氨基酸序列构成的蛋白质。

15、[6]由序列号26所示的氨基酸序列构成的蛋白质。

16、2. 根据上述1所述的微生物，其中，上述具有路易斯x骨架的低聚糖为具有乳糖-n-岩藻五糖iii(lnfpiii)骨架的低聚糖。

17、3. 根据上述2所述的微生物，其中，上述具有lnfpiii骨架的低聚糖为lnfpiii和乳糖-n-新双岩藻基六糖ii(lnndfhii)中的至少一者。

18、4. 根据上述1所述的微生物，其中，上述具有路易斯x骨架的低聚糖为在对-乳糖-n-新六糖(para-lnnh)骨架中含有的至少一个n-乙酰葡糖胺的3位以α1,3-键结合有l-岩藻糖的低聚糖。

19、5. 一种低聚糖的制造方法，其特征在于，制备上述1～4中任一项所述的微生物以及使用该微生物在培养物中生成低聚糖。

20、发明效果

21、本发明的微生物通过增强特定蛋白质的活性而能够向底物的n-乙酰葡糖胺部位选择性地转移岩藻糖、使具有路易斯x骨架的低聚糖以外的副产物的生成减少、提高具有路易斯x骨架的低聚糖的生产率。

技术特征：

1.一种微生物，其中，下述[1]～[6]中任一项记载的蛋白质的活性得到增强、并且与亲株相比具有路易斯x骨架的低聚糖的生产率提高，

2.根据权利要求1所述的微生物，其中，所述具有路易斯x骨架的低聚糖为具有乳糖-n-岩藻五糖iii(lnfpiii)骨架的低聚糖。

3.根据权利要求2所述的微生物，其中，所述具有lnfpiii骨架的低聚糖为lnfpiii和乳糖-n-新双岩藻基六糖ii(lnndfhii)中的至少一者。

4.根据权利要求1所述的微生物，其中，所述具有路易斯x骨架的低聚糖为在对-乳糖-n-新六糖(para-lnnh)骨架中含有的至少一个n-乙酰葡糖胺的3位以α1,3-键结合有l-岩藻糖的低聚糖。

5.一种低聚糖的制造方法，其特征在于，制备权利要求1～4中任一项所述的微生物以及使用该微生物在培养物中生成低聚糖。

技术总结本发明涉及一种微生物，其中，下述[1]～[4]中任一项记载的蛋白质的活性得到增强、并且与亲株相比具有路易斯X骨架的低聚糖的生产率提高：[1]由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质；[2]由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有α1,3‑岩藻糖基转移酶活性的突变蛋白；[3]由与序列号2所示的氨基酸序列具有90%以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有α1,3‑岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白；以及[4]由序列号24、18或26所示的氨基酸序列构成的蛋白质。技术研发人员：杉田智惇受保护的技术使用者：麒麟控股株式会社技术研发日：技术公布日：2024/9/9