具有改善的质构化性质的嗜热链球菌菌株的制作方法

本发明涉及具有改善的质构化性质的嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)突变体。此外，本发明涉及包含这些突变体中的一种或更多种的组合物(如发酵剂)、使用这些突变体制成的发酵产品以及本发明的突变体和组合物的用途。

背景技术：

0、发明背景

1、食品工业使用许多细菌，特别是乳酸菌，以改善食品的质构。在乳业中，广泛使用乳酸菌不仅为了实现乳的酸化(通过发酵)，而且也为了对掺入其的产品进行质构化。

2、在食品工业使用的乳酸菌当中，主要应用的是链球菌属(streptococcus)、乳球菌属(lactococcus)、乳杆菌属(lactobacillus)、明串珠菌属(leuconostoc)、小球菌属(pediococcus)和双歧杆菌属(bifidobacterium)。嗜热链球菌(streptococcusthermophilus，s.thermophilus)的种的乳酸菌可广泛地单独使用或与其它细菌如德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus，l.bulgaricus)组合用于生产食品，尤其是发酵食品。它们被特别地用于配制生产发酵乳(例如酸奶)的发酵物。它们中的某些在发酵产品质构的形成中起着主导作用。该特性与细胞外聚合物(胞外多糖，eps)的产生密切相关，其由乳酸菌分泌到周围环境中。

3、人们渴望获得具有高质构的发酵乳制品。例如，目前酸奶生产的趋势是追求温和风味和高质构。如今这是通过使用产生温和风味的培养物和添加增稠剂或蛋白质以获得所需稠度来实现的。发酵产品生产商(如酸奶生产商)希望能够在不添加增稠剂的情况下制造具有这些特性的发酵产品，如酸奶。这将帮助他们降低成本，并提供更无害的标签。实现这一点的一个非常有吸引力的方法是拥有产生高质构层次的发酵剂。

4、许多嗜热链球菌菌株合成胞外多糖(eps)。这些分子可被生产为与细胞紧密结合的胶囊，或者它们可以作为松散的粘液(即，“粘稠的”多糖)释放到培养基中。尽管胞外多糖的存在不会给乳中嗜热链球菌的生长或存活带来任何明显的优势，但是该物种或其他乳品乳酸菌的原位生产通常赋予发酵乳制品所需的“粘稠”或粘性质构。研究还表明，产生胞外多糖的嗜热链球菌可以增强发酵乳制品的功能特性。有关更多详情，请参见broadbent等人的综述文章(j.dairy sci.,2003,86:407-423)。

5、为满足行业要求，有必要提供新型的质构化乳酸菌(特别是嗜热链球菌)菌株用于质构化食品。尤其需要可与质构化乳杆菌(lactobacillus)(例如保加利亚乳杆菌)菌株一起使用的新型质构化嗜热链球菌菌株。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明提供具有改善性质的新型嗜热链球菌菌株，特别是与其改善发酵食品(如乳制品，例如酸奶)以及乳制品类似产品的质构的能力有关的新型嗜热链球菌菌株，并且所述菌株可用于当今高度工业化的发酵食品生产。

2、本发明的一个方面涉及嗜热链球菌菌株，该菌株具有(ⅰ)支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:12的位置169的位置处谷氨酸对缬氨酸的取代。在另一方面，本发明涉及嗜热链球菌菌株，该菌株具有支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:11的位置506的位置处核苷酸a对核苷酸t的取代。

3、在本发明的一个方面中，嗜热菌菌株具有(ⅱ)abc转运体透性酶蛋白基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:4的位置190的位置处亮氨酸对苯丙氨酸的取代。在另一个方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有额外的abc转运体透性酶蛋白基因突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:3的位置568的位置处核苷酸c对核苷酸t的取代。

4、在本发明的一个方面，嗜热链球菌菌株具有(ⅲ)肽脱甲酰基酶蛋白基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:8的位置144的位置处精氨酸对半胱氨酸的取代。在另一方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有肽脱甲酰基酶蛋白基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:7的位置430的位置处核苷酸c对核苷酸t的取代。

5、在一方面，嗜热链球菌菌株具有(ⅰ)支链氨基酸转运atp结合蛋白livg基因中的突变。在一方面，嗜热链球菌菌株具有(ⅱ)abc转运体透性酶蛋白基因中的突变。在一方面，嗜热链球菌菌株具有(ⅲ)肽脱甲酰基酶蛋白基因中的突变。在另一方面，嗜热链球菌菌株具有如上所述突变中的两种，如突变(ⅰ)和突变(ⅱ)，即支链氨基酸转运atp结合蛋白livg基因和abc转运体透性酶蛋白基因中的突变；例如如上所述的突变(ⅰ)和突变(ⅲ)，如上所述，或者例如如上所述的突变(ⅱ)和突变(ⅲ)。在优选的方面，嗜热链球菌菌株具有如上所述的所有三种突变(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ)。

6、因此，本发明涉及嗜热链球菌菌株，其(ⅰ)在对应于seq id no.:12的位置169的位置处具有缬氨酸和/或在对应于seq id no.:11的位置506的位置处具有t(支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因)。本发明涉及嗜热链球菌菌株，其(ⅱ)在对应于seqid no.:4的位置190的位置处具有苯丙氨酸和/或在对应于seq id no.:3的位置568的位置处具有t(abc转运体透性酶蛋白基因)。本发明涉及嗜热链球菌菌株，其(ⅲ)在对应于seqid no.:8的位置144的位置处具有半胱氨酸和/或在对应于seq id no.:7的位置430的位置处具有t(肽脱甲酰基酶蛋白基因)。在优选的方面，本发明的嗜热链球菌菌株的支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因在对应于seq id no.:11的位置506的位置处具有t，和/或支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)在对应于seq id no.:12的位置169的位置处具有缬氨酸。在另一优选的方面，本发明的嗜热链球菌菌株的abc转运体透性酶蛋白基因在对应于seq id no.:3的位置568的位置处具有t和/或abc转运体透性酶蛋白基因在对应于seq id no.:4的位置190的位置处具有苯丙氨酸。在另一方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有如上所述的(ⅰ)和(ⅱ)。在另一方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有如上所述的(ⅰ)和(ⅲ)。在另一方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有如上所述的(ⅱ)和(ⅲ)。在优选的方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有如上所述的(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ)。

7、优选地，嗜热链球菌菌株是dsm22933或其突变体或变体，优选地，其中该突变体或变体显示与dsm22933相同或相似的质构化性质。

8、在一个方面，本发明涉及包含所述嗜热链球菌菌株的组合物。

9、在一个方面，本发明涉及生产发酵产品的方法，其包括用嗜热链球菌菌株或本发明的组合物发酵底物。

10、在一个方面，本发明涉及可通过根据本发明的方法获得的发酵食品或包含本发明的嗜热链球菌菌株的发酵食品或包含根据本发明的组合物的发酵食品。

11、本发明还涉及制造本发明所定义的嗜热链球菌菌株的方法；其中，该菌株优选通过使用菌株dsm22587作为起始原料(即作为母本菌株)来获得。

12、本发明还涉及本发明的嗜热链球菌菌株，或根据本发明的组合物用于制造发酵产品，优选用于制造发酵乳制品的用途。

13、序列表

14、seq id no.:1列出dsm22587的abc转运体透性酶的核苷酸序列。

15、seq id no.:2列出dsm22587的abc转运体透性酶的氨基酸序列。

16、seq id no.:3列出dsm22933的abc转运体透性酶的核苷酸序列。

17、seq id no.:4列出dsm22933的abc转运体透性酶的氨基酸序列。

18、seq id no.:5列出dsm22587的肽脱甲酰基酶的核苷酸序列。

19、seq id no.:6列出dsm22587的肽脱甲酰基酶的氨基酸序列。

20、seq id no.:7列出dsm22933的肽脱甲酰基酶的核苷酸序列。

21、seq id no.:8列出dsm22933的肽脱甲酰基酶的氨基酸序列。

22、seq id no.:9列出dsm22587的支链氨基酸转运atp结合蛋白livg的核苷酸序列。

23、seq id no.:10列出dsm22587的支链氨基酸转运atp结合蛋白livg的氨基酸序列。

24、seq id no.:11列出dsm22933的支链氨基酸转运atp结合蛋白livg的核苷酸序列。

25、seq id no.:12列出dsm22933的支链氨基酸转运atp结合蛋白livg的氨基酸序列。

26、abc转运体透性酶，dsm22587

27、seq id no.:1-dna序列，2001bp

28、

29、

30、seq id no.:2-aa序列，666个氨基酸

31、

32、abc转运体透性酶，dsm22933

33、seq id no.:3-dna序列，2001bp

34、

35、seq id no.:4-aa序列，666个氨基酸

36、

37、肽脱甲酰基酶，dsm22587

38、seq id no.:5-dna序列，615bp

39、

40、seq id no.:6-aa序列，204个氨基酸

41、

42、肽脱甲酰基酶，dsm22933

43、seq id no.:7-dna序列，615bp

44、

45、seq id no.:8-aa序列，204个氨基酸

46、

47、支链氨基酸转运atp结合蛋白livg，dsm22587

48、seq id no.:9-dna序列，765bp

49、

50、seq id no.:10-aa序列，254个氨基酸

51、

52、支链氨基酸转运atp结合蛋白livg，dsm22933

53、seq id no.:11-dna序列，765bp

54、

55、seq id no.:12-aa序列，254个氨基酸

56、

57、详细描述

58、定义

59、本文相关术语的所有定义均符合技术人员对本文相关技术背景的理解。

60、在本技术的上下文中，术语“乳”以其常规含义指由动物(例如，奶牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼等)的乳腺产生的液体。

61、术语“乳基质”可以是可经受本发明的方法的发酵的任何生乳和/或加工乳材料。因此，有用的乳基质包括(但不限于)任何乳的溶液/悬浮液，例如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原奶粉、炼乳、干乳、乳清、乳清渗透物、乳糖、由乳糖结晶获得的母液、乳清蛋白浓缩物或乳脂(cream)。显然，乳基质可来源于任何哺乳动物，例如基本上纯的哺乳动物乳，或复原乳粉。优选地，乳基质中的至少部分蛋白质是哺乳动物乳中天然存在的蛋白质，例如酪蛋白或乳清蛋白。然而，部分蛋白质可能是乳中天然不存在的蛋白质。

62、在发酵之前，可根据所属领域已知的方法对乳基质进行均质化和巴氏灭菌。

63、如在本发明的上下文中，在其任一实施方案中所用的“均质化”是指充分混合以获得可溶的悬浮液或乳液。如果均质化在发酵前进行，这样做可以将乳脂分解成更小的尺寸，使其不再与乳分离。这可通过在高压下迫使乳通过小孔来实现。

64、在本发明的上下文中，在其任一实施方案中所用的“巴氏灭菌”是指处理乳基以减少或消除例如微生物等活生命体的存在。优选地，巴氏灭菌是通过将指定温度维持指定时段来实现。指定温度通常通过加热来实现。可选择温度和持续时间以便杀死或灭活特定细菌，例如有害细菌。随后可进行快速冷却步骤。

65、在本发明的上下文中，在其任一实施方案中的“发酵”是指通过微生物(例如，乳酸菌(lab))的作用将碳水化合物转化为酸或醇或两者的混合物。在食品如乳制品生产中使用的发酵工艺是公知的，且所属领域技术人员将了解如何选择合适的工艺条件，例如温度、氧、微生物的量以及工艺时间。在其任何实施方案中，选择支持本发明的实现的发酵条件，例如，为了获得发酵食品，如发酵乳制品，像奶制品，优选地为这样的发酵食品，其与使用不涉及使用本发明的菌株或使用本发明的组合物的方法生产的食品相比具有改善的质构。

66、术语“发酵乳”和“乳品”在本文中可互换使用。在本发明的上下文中，在其任一实施方案中，表述“发酵乳制品”是指食品或饲料产品，其中食品或饲料产品的制备涉及用乳酸菌发酵乳基。本文所用的“发酵乳制品”包括但不限于嗜热发酵乳制品或嗜温发酵乳制品等产品。本文中的术语“高温发酵”是指在约35℃以上的温度发酵，如在约35℃至约45℃。本文中的术语“中温发酵”是指在约22℃至约35℃的温度发酵。

67、在本发明的上下文中，在其任一实施方案中，词语“乳酸菌”(“lab”)指产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的食品级细菌。这些细菌因其共同的代谢特性和生理特性而相关，且是革兰氏阳性、低gc、耐酸、非孢子、杆状杆菌或球菌。在发酵阶段，这些细菌消耗碳水化合物导致乳酸的形成，其降低ph并导致蛋白凝结物的形成。因此，这些细菌负责乳的酸化和乳制品的质构。本发明的嗜热链球菌菌株被归类为乳酸菌。

68、在本上下文中，术语“发酵剂”是培养物，其是一种或30多种细菌菌株(如乳酸菌菌株)的制剂，以在制备发酵产品如各种食品、饲料和饮料中协助发酵工艺。在本上下文中，“酸奶发酵剂”是包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和至少一种嗜热链球菌菌株的细菌培养物。据此，“酸奶”是指能够通过用包含保加利亚乳杆菌菌株和嗜热链球菌菌株的组合物接种和发酵乳底物而获得的发酵乳制品。

69、“质构”也是发酵乳制品的重要品质因素，且消费者的接受度往往与质构特性密切相关。发酵乳的质构取决于胞外多糖结构、用于发酵的细菌和工艺参数以及乳成分。在本发明的上下文下，发酵乳制品的流变特性(质构)，例如粘度，可以作为发酵乳制品的剪切应力的函数进行测量，如下所述。粘度也可以通过移液管粘度测试来测量，如下面的实例2和实例3所述。此外，还可以通过抽吸试验来评估质构化性质，如下面的实例4所述。

70、本说明书和权利要求中的“质构化菌株”优选是产生发酵乳的菌株，其在下文所述的条件下以及如本文的实例中所示例的，在300s-1的剪切速率测量时具有优选大于40pa(如44pa或更高)的剪切应力。嗜热链球菌菌株可被定义为强质构化的，因为它产生的发酵乳在相同条件下，在300s-1的剪切速率测量时具有53pa或更高的剪切应力。

71、将200ml乳(3.6％蛋白质，1.5％或3％脂肪)加热至95℃持续5min，然后冷却至接种温度(43℃)，并接种包含乳酸菌菌株的0.02％fd-dvs发酵剂，并在接种温度(43℃)下放置至ph4.60，然后在6℃下储存7天，然后轻轻搅拌，并在13℃下以300s-1的剪切速率测量剪切应力。

72、就本发明而言，“剪切应力”可以通过以下方法测量：当发酵乳(例如，哺乳动物基乳或植物基乳)的ph在孵育温度(例如，43℃)下达到ph约4.60时，将发酵乳制品通过把容器转移到冰水中冷却，并任选地在6℃下储存7天。借助装有穿孔圆片的棒轻轻地手动搅拌发酵乳样品直至样品均匀。样品的流变特性在流变仪(anton paar physica rheometer withasc,automatic sample changer,antongmbh,austria)上通过使用bob杯进行评估。在测量期间，将流变仪设置为13℃的恒定温度。设置如下：

73、-放置时间(重建到某种原始结构)

74、-5分钟，没有任何物理应力(振荡或旋转)施加到样品上。

75、-振荡步骤(分别测量弹性模量和粘性模量g’和g”，从而计算复数模量g*)

76、恒定应变＝0.3％，频率(f)＝[0.5…8]hz

77、60s内6个测量点(每10s一个)

78、-旋转步骤(以300 1/s测量剪切应力)

79、-设计了两个步骤：

80、-剪切速率＝[0.3-300]1/s和2)剪切速率＝[275-0.3]1/s。

81、每个步骤在210s内含21个测量点(每10s一个)。选择300 1/s(300s-1)的剪切应力进行进一步分析，因为这与吞咽发酵乳制品时的口感厚度相关。

82、如本文所用，“移液管粘度测试”是指通过确定某容量移液管的流出时间来确定产品粘度的方法。流出时间越长，粘度越高，另见实例2：

83、凝乳由接种了1％待测细菌菌株(来自在37℃脱脂乳中生长过夜的培养物)的200ml脱脂乳制成，并在42℃或37℃下孵育20h。凝乳的粘度用25ml容量移液管测量，其中重复测量所述凝乳从移液管的流出时间三次。用勺子仔细搅拌凝乳，使其均匀。然后填充25ml容量移液管，并测量在重力作用下排空移液管的时间。从移液管中排空25ml凝乳所需的时间以秒为单位记录。

84、如本文所用，术语“噬菌体”具有本领域所理解的常规含义，即选择性感染一种或更多种细菌的病毒。许多噬菌体对特定的细菌属或种或株是特异的。术语“噬菌体(bacteriophage)”与术语“噬菌体(phage)”同义。噬菌体可包括但不限于属于以下任何病毒科的噬菌体：覆盖噬菌体科(corticoviridae)、囊状噬菌体科(cystoviridae)、丝杆噬菌体科(inoviridae)、光滑噬菌体科(leviviridae)、微小噬菌体科(microviridae)、肌尾噬菌体科(myoviridae)、短尾噬菌体科(podoviridae)、长尾噬菌体科(siphoviridae)或复层噬菌体科(tectiviridae)。噬菌体可以是裂解性噬菌体或溶原性噬菌体。裂解性噬菌体是通过完成裂解循环来遵循裂解途径，而不是进入溶原途径的噬菌体。裂解性噬菌体进行病毒复制，导致细胞膜裂解、细胞破坏，并释放出能够感染其他细胞的子代噬菌体颗粒。溶原性噬菌体是一种能够进入溶原途径的噬菌体，在其溶原周期完成之前，噬菌体成为细胞基因组的休眠、被动部分。

85、在本发明的上下文中，“噬菌体抗性突变体”指的是已经形成抵御噬菌体机制的细菌菌株。在一个实施方案中，根据本发明的乳酸菌对一种或更多种噬菌体或一组或更多组噬菌体具有抗性；在另一个实施方案中，根据本发明的乳酸菌对根据本发明的保藏的菌株所抵抗的相同噬菌体具有抗性。优选地，根据本发明的乳酸菌对噬菌体dsm24022具有抗性。在本上下文中，术语“噬菌体稳健性”与术语“噬菌体抗性”可互换使用。根据本发明的噬菌体抗性突变体可以如以下实施例1所述获得。

86、在本上下文中，术语“衍生于……的菌株”、“衍生的菌株”或“突变体”应理解为通过例如遗传工程、辐射和/或化学处理和/或选择、适应、筛选等手段自另一菌株(或“母本菌株”)获得的菌株。突变体也可以是自发形成的突变体。优选地，衍生菌株是功能等同的突变体，例如，在例如生长和酸化特性方面与母本菌株具有基本相同或改善的特性的菌株。此类衍生菌株是本发明的一部分。特别地，术语“衍生的菌株”或“突变体”是指使母本菌株经受任何常规使用的诱变处理(包括用例如乙烷甲烷磺酸盐(ems)或n-甲基-n'-硝基-n-硝基胍(ntg)等化学诱变剂、uv光处理)而获得的菌株，或自发形成的突变体。突变体也可以通过定点诱变产生。

87、突变体可能已经经历数次诱变处理(单次处理应被理解为一个诱变步骤，接着是筛选/选择步骤)，但目前优选执行不超过20次、不超过10次或不超过5次处理。在目前优选的衍生菌株中，与母本菌株相比，细菌基因组中小于1％或小于0.1％、小于0.01％、小于0.001％或甚至小于0.0001％的核苷酸被改变(例如通过替换、插入、缺失或其组合)。

88、在本上下文中，术语“变体”应理解为功能与本发明的菌株等效的菌株，例如具有基本上相同或改善的性质(例如关于粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体稳健性)。可使用适当的筛选技术鉴定的此类变体是本发明的一部分。

89、术语“序列同一性”涉及两个核苷酸序列之间或两个氨基酸序列之间的相关性。用于比对序列和确定它们之间序列同一性程度的算法是本领域公知的。出于本发明的目的，例如，使用具有标准参数的多个序列比对工具clustal omega(https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/；sievers et al.,2011)确定两个核苷酸序列或两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。

90、出于本发明的目的，例如，使用在emboss软件包(emboss:the europeanmolecular biology open software suite,rice et al.(2000)trends in genetics 16:276-277)的needle程序中实施的needleman-wunsch算法(needleman and wunsch(1970)j.mol.biol.48:443-453)，优选3.0.0或更高版本，来确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和eblosum62(blosum62的emboss版本)替代矩阵。将标有“最长同一性”的needle输出(使用-no brief30选项获得)用作同一性百分比，并计算如下：

91、(相同残基×100)/(比对长度-比对中总空位数)。

92、出于本发明的目的，可以使用美国国家生物技术信息中心(ncbi)在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov上应用标准参数提供的blastn进行核苷酸序列比对的方法。

93、在本说明书和权利要求中，使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。为了便于参考，本发明的突变体和变体中的氨基酸变化使用以下命名法描述：亲本蛋白中的氨基酸残基；位置；取代的氨基酸残基。根据该命名法，例如，在位置169处谷氨酸残基替换为缬氨酸残基表示为glu169val或e169v。

94、在本发明的上下文中，基因中的突变(“基因突变”)应理解为生物体基因组的核苷酸序列的改变，其导致所述生物体的表型的变化，其中所述改变可以是核苷酸的缺失、核苷酸被另一个核苷酸取代、核苷酸的插入或移码。在本发明的上下文中，“缺失”应理解为导致生物体基因组的核苷酸序列的一个或更多个核苷酸去除的基因突变；“插入”应理解为向核苷酸序列添加一个或更多个核苷酸；“取代”(或“点突变”)应理解为基因突变，其中核苷酸序列的核苷酸被另一个核苷酸取代。在本发明的上下文中，基因中的突变是指包含在基因中的任何元件的核苷酸序列的改变。例如，一个基因可以包含几个元件或部分，如不同的调控序列(增强子、沉默子、启动子、5’和3’utr等)和开放阅读框区(其包含内含子和外显子)。因此，在本发明的上下文中，某一基因中的突变应理解为所述基因的核苷酸序列中的改变，该改变位于该基因的调控元件中(如该基因的启动子中)和/或该基因的开放阅读框中(如外显子中)。如果突变发生，例如，在外显子的序列中，突变可能导致翻译蛋白质中出现不同的氨基酸。如果突变发生，例如，在基因的调控区域，突变可能导致基因表达增强(或减少)，例如，蛋白量增加(或减少)。

95、在本发明的上下文中，在对应于某一序列中某一位置的位置处一个氨基酸或核苷酸对另一个氨基酸或核苷酸的取代或突变意味着，在突变的氨基酸或核苷酸序列中，除了特定位置(或在对应于该特定位置的位置上，例如，在突变序列中有缺失或插入的情况下)上的特定取代或突变之外，还可能有其它突变(例如，缺失、插入、取代等)。因此，在本发明的上下文中，例如，短语“支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)中的突变是在对应于seq id no.:12的位置169的位置处谷氨酸对缬氨酸的取代和/或在对应于seq idno.:11的位置506的位置处核苷酸a对核苷酸t的突变”可能意味着：

96、(i)在支链氨基酸转运atp-结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)的突变的氨基酸或核苷酸序列中，恰好在seq id no.:12的位置169的位置处有谷氨酸对缬氨酸的取代，或者恰好在seq id no.:11的位置506的位置处有核苷酸a对核苷酸t的取代(突变)。当然，不排除seqid no.:12或seq id no.:11中的其他取代或突变；

97、(ii)在序列中存在其他突变如插入或缺失的情况下，谷氨酸对缬氨酸或核苷酸a对核苷酸t的特定取代可能因为其它突变如插入或缺失不再精准位于seq id no.:12的位置169或seq id no.:11的位置506。在这些情况下，考虑到序列中的其它突变所提及的谷氨酸对缬氨酸或核苷酸a对核苷酸t的取代应处于一个将对应于seq id no.:12的位置169或seq id no.:11的位置506的位置。技术人员能够鉴定“对应于某一序列中某一位置的位置”，例如，通过对序列进行对齐，并找到与原始序列中的某一位置相对应的位置。

98、相应的含义将适用于短语“abc转运体透性酶蛋白中的突变是在对应于seq idno.:4的位置190的位置处亮氨酸对苯丙氨酸的取代和/或在对应于seq id no.:3的位置568的位置处核苷酸c对核苷酸t的突变”和“肽脱甲酰酶蛋白中的突变是在对应于seq idno.:8的位置144的位置处精氨酸对半胱氨酸的取代和/或在对应于seq id no.:7的位置430的位置处核苷酸c对核苷酸t的突变”。

99、在本说明书和权利要求书中，核苷酸的常规单字母代码的使用遵循上述氨基酸命名法所述的类似原理。

100、如本文所用，术语“约(about)”(或“约(around)”)是指其值为所示值±1％，或术语“约”是指其值为所示值±2％，或术语“约”是指其值为所示值±5％，术语“约”是指其值为所示值±10％，或术语“约”是指其值为所示值±20％，或术语“约”是指其值为所示值±30％；优选地，术语“约”确切地是指所示值(±0％)。

101、在整个说明书和权利要求书中，词语“包括/包含(comprise)”和该词的变体(例如，“包括/包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”、“含有(containing)”)通常不具有限制性，且因此不排除其他特征，其可以是例如技术特征、添加剂、组分或步骤。然而，每当本文使用词语“包括/包含(comprise)”时，这也包括，其中该词被理解为限制性的特殊实施方案；在该特定的实施方案中，词语“包括/包含(comprise)”具有术语“由……组成(consist of)”的含义。

102、在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一种/个(a，an)”和“所述/该(the)"以及类似指代的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非本文另有说明，否则本文对数值范围的叙述仅旨在作为单独指该范围内的每个单独数值的简写方法，并且将每个单独值并入说明书中，就好像其在本文中单独叙述一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。

103、本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，"诸如")的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制，除非另有要求。说明书中的任何语言不应被解释为指示任何未要求的要素对于本发明的实践是必不可少的。

104、根据本发明，粘度可以(并且优选)如实施例2和实施例3中所述进行测量。根据本发明，抽吸可以(并且优选)如实施例4中所述进行测量。根据本发明，乳酸菌或混合物的流变特性如剪切应力可以(并且优选)如实施例5所述进行测量。

105、嗜热链球菌菌株

106、本发明人令人惊讶地鉴定出满足工业需求的嗜热链球菌菌株。与母本菌株母本菌株相比，当新菌株单独应用或作为乳品基质中混合培养物的一部分应用时，例如，显示出改善的流变性质(如质构)。新型嗜热链球菌菌株具有用于如乳品培养物，如酸奶培养物的能力，以获得改善的流变参数，如成品的剪切应力、粘度和凝胶硬度。流变性与产品的感官品质密切相关，且因此流变性与成品味道之间的相互作用至关重要。

107、本发明人惊奇地发现，具有支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因突变的嗜热菌菌株具有比其母本菌株，即比在支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc3.a.1.4.1)基因中没有相同突变的菌株，更好的质构特性。特别是，本发明人已经发现支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因中的突变(其中该突变是在对应于seqid no.:12的位置169的位置处谷氨酸对缬氨酸的取代)与更好的质构化性质相关。例如，本发明人惊奇地发现，具有支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因突变的嗜热链球菌菌株(其中该突变是在对应于seq id no.:11的位置506的位置处核苷酸a对核苷酸t的取代)显示出比其母本菌株更好的质构化性质。这在实施例中有体现。因此，本发明人惊奇地发现，在对应于seq id no.:12的位置169的位置处具有缬氨酸和/或在对应于seqid no.:11(支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因)的位置506的位置处具有t的嗜热链球菌菌株相比在对应于seq id no.:12的位置169的位置处没有缬氨酸(例如，可能具有对应于seq id no.:12的位置169的位置处的谷氨酸的菌株)和/或在对应于seqid no.:11的位置506的位置处没有t(例如，可能具有对应于seq id no.:11的位置506的位置处的a的菌株)的嗜热链球菌菌株显示出更好的质构化性质。

108、因此，本发明的第一方面涉及嗜热链球菌菌株，该菌株具有(ⅰ)支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:12的位置169的位置处谷氨酸对缬氨酸的取代。在另一方面，本发明涉及嗜热链球菌菌株，该菌株具有(ⅰ)支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:11的位置506的位置处核苷酸a对核苷酸t的取代。因此，本发明还涉及嗜热链球菌菌株，其在对应于seq id no.:12的位置169的位置处具有缬氨酸和/或在对应于seq id no.:11(支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因)的位置506的位置处具有t。

109、此外，本发明人惊奇地发现，具有abc转运体透性酶蛋白基因突变的嗜热菌菌株比其母本菌株母本菌株，即比在abc转运体透性酶蛋白基因中没有相同突变的菌株，具有更好的质构化性质。特别是，本发明人已经发现abc转运体透性酶蛋白基因中的突变(其中该突变是在对应于seq id no.:4的位置190的位置处亮氨酸对苯丙氨酸的取代)与更好的质构化性质相关。例如，本发明人惊奇地发现，具有abc转运体透性酶蛋白基因突变(其中该突变是在对应于seq id no.:3的位置568的位置处核苷酸c对核苷酸t的取代)的嗜热链球菌菌株显示出比母本菌株母本菌株更好的质构化性质。这在实施例中有体现。因此，本发明人惊奇地发现，在对应于seq id no.:4的位置190的位置处具有苯丙氨酸和/或在对应于seq idno.:3(abc转运体透性酶蛋白基因)的位置568的位置处具有t的嗜热链球菌菌株相比于在对应于seq id no.:4的位置190的位置处没有苯丙氨酸的嗜热链球菌菌株(例如，在对应于seq id no.:4的位置190的位置处具有亮氨酸的菌株)和/或在对应于seq id no.:3的位置568的位置处没有t的菌株(例如，在对应于seq id no.:3的位置568的位置处具有c的菌株)，显示出更好的质构化性质。

110、因此，本发明的嗜热链球菌菌株具有(ⅱ)abc转运体透性酶蛋白基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:4的位置190的位置处亮氨酸对苯丙氨酸的取代。例如，本发明的嗜热链球菌菌株具有(ⅱ)abc转运体透性酶蛋白基因突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:3的位置568的位置处核苷酸c对核苷酸t的取代。因此，本发明还涉及嗜热链球菌菌株，其(ⅱ)对应于seq id no.:4的位置190的位置处的苯丙氨酸和/或对应于seq id no.:3的位置568的位置处的t(abc转运体透性酶蛋白基因)。

111、此外，本发明人惊奇地发现，具有肽脱甲酰基酶蛋白基因中的突变的嗜热菌菌株具有比其母本菌株，即比在肽脱甲酰基酶蛋白基因中没有相同突变的菌株，更好的质构化性质。特别是，本发明人已经发现肽脱甲酰基酶蛋白基因中的突变(其中该突变是在对应于seq id no.:8的位置144的位置处精氨酸对半胱氨酸的取代)与更好的质构化性质相关。例如，本发明人惊奇地发现，具有肽脱甲酰基酶蛋白基因突变(其中该突变是在对应于seq idno.:7的位置430的位置处核苷酸c对核苷酸t的取代)的嗜热链球菌菌株显示出比母本菌株母本菌株更好的质构化性质。这在实施例中有体现。因此，本发明人惊奇地发现，在对应于seq id no.:8的位置144的位置处具有半胱氨酸和/或在对应于seq id no.:7(肽脱甲酰基酶蛋白基因)的位置430的位置处具有t的嗜热链球菌菌株显示出相比在对应于seq idno.:8的位置144的位置处没有半胱氨酸的嗜热链球菌菌株(例如，在对应于seq id no.:8的位置144的位置处有精氨酸的菌株)和/或在对应于seq id no.:7的位置430的位置处没有t的菌株(例如，在对应于seq id no.:7的位置430的位置处有c的菌株)，。

112、因此，本发明的嗜热链球菌菌株具有(ⅲ)肽脱甲酰基酶蛋白基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:8的位置144的位置处精氨酸对半胱氨酸的取代。例如，本发明的嗜热链球菌菌株具有(ⅲ)肽脱甲酰基酶蛋白基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:7的位置430的位置处核苷酸c对核苷酸t的取代。因此，本发明涉及嗜热链球菌菌株，其具有(ⅲ)对应于seq id no.:8的位置144的位置处的半胱氨酸和/或对应于seq id no.:7的位置430的位置处的t(肽脱甲酰基酶蛋白基因)。

113、优选地，本发明的嗜热葡萄球菌菌株具有如上所述的突变(ⅰ)至突变(ⅲ)中的至少两种，优选突变(ⅰ)和突变(ⅱ)，即(i)支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:12的位置169的位置处谷氨酸对缬氨酸的取代或其中该突变优选是在对应于seq id no.:11的位置506的位置处核苷酸a对核苷酸t的取代，以及(ⅱ)abc转运体透性酶蛋白基因中的突变，其中该突变优选是在对应于seq id no.:4的位置190的位置处亮氨酸对苯丙氨酸的取代或其中该突变优选是在对应于seq id no.:3的位置568的位置处核苷酸c对核苷酸t的取代。在另一方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有如上所述的突变(ⅰ)和突变(ⅲ)，或者具有如上所述的突变(ⅱ)和突变(ⅲ)。

114、在一个实施方案中，本发明的嗜热链球菌菌株在蛋白质序列和/或核苷酸序列中具有如上所述(ⅰ)至(ⅲ)的所有三种突变。

115、在一个实施方案，本发明的嗜热链球菌菌株的支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因在对应于seq id no.:11的位置506的位置处具有t，和/或支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)在对应于seq id no.:12的位置169的位置处具有缬氨酸。在另一优选的方面，本发明的嗜热链球菌菌株的abc转运atp结合蛋白基因在对应于seq id no.:3的位置568的位置处具有t和/或abc转运atp结合蛋白在对应于seq id no.:4的位置190的位置处具有苯丙氨酸。在另一方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有如上所述的(ⅰ)和(ⅱ)。在另一方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有如上所述的(ⅰ)和(ⅲ)。在另一方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有如上所述的(ⅱ)和(ⅲ)。在优选的方面，本发明的嗜热链球菌菌株具有如上所述的(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ)。

116、优选地，当用于对乳发酵时，本发明的嗜热链球菌菌株在移管粘度器测试中产生的剪切应力和/或流出时间(如本文所述以及实施例中所测量的)高于不包含任何上述突变(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的菌株。在本发明的一个实施方案中，不包含任何上述突变(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的菌株是本发明的嗜热链球菌菌株来源的母本菌株。在本发明的一个实施方案中，不包含任何上述突变(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的菌株是菌株dsm22587。

117、在本发明的一个实施方案中，突变株具有噬菌体抗性、实质性噬菌体抗性和/或与其母本菌株相比具有增加的噬菌体抗性。这意味着母本菌株易被噬菌体感染(裂解)，但突变株对相同噬菌体的感染(裂解)有抗性。优选地，本发明的嗜热链球菌菌株对噬菌体dsm24022具有抗性。在一个实施方案中，本发明的嗜热链球菌菌株是来自菌株dsm22587的噬菌体抗性突变体。优选地，本发明的嗜热链球菌菌株是来自菌株dsm22587的突变体，该突变体对噬菌体dsm24022具有抗性。

118、甚至更优选地，本发明的嗜热链球菌菌株是dsm22933或其突变体或变体。优选地，突变体或变体表现出与dsm22933相同或相似的质构化性质，例如，相同或相似的剪切应力和/或相同或相似的粘度特性。因此，可以设想，本发明的嗜热链球菌菌株，包括dsm22933的突变体和变体，至少表现出与dsm22933相同或相似的剪切应力和/或粘度特性和/或质构化性质，如本实施例中所述。因此，本发明还提供嗜热链球菌菌株dsm22933或其突变体或变体。

119、在本上下文中，术语“相同或相似的剪切应力”应理解为从低于dsm22933的剪切应力特性10％到高于dsm22933的剪切应力特性10％的范围，该范围也可以低于/高于dsm22933的剪切应力特性9％，例如低于/高于dsm22933的剪切应力特性8％，例如低于/高于dsm22933的剪切应力特性7％，例如低于/高于dsm22933的剪切应力特性6％，例如低于/高于dsm22933的剪切应力特性5％，例如低于/高于dsm22933的剪切应力特性4％，例如低于/高于dsm22933的剪切应力特性3％，例如低于/高于dsm22933的剪切应力特性2％或低于/高于dsm22933的剪切应力特性1％。dsm22933的剪切应力特性按说明书所述或实施例5所述进行测量。例如，dsm2293的剪切应力特性可以在混合培养物中进行测量，如实施例5中所述。例如，对dsm2293的剪切应力特性可以如下测量：剪切应力数据是通过在乳(3.6％蛋白质和1.5％或3％脂肪)中接种相同的微生物培养物获得的；将乳在95℃加热5min并冷却至接种温度(43℃)，然后接种30％的待测质构化菌株、60％的另一种嗜热链球菌菌株和10％的保加利亚乳杆菌菌株，或乳在95℃下加热5min并冷却至接种温度(43℃)，然后接种50％的待测质构化菌株、25％的另一种嗜热链球菌菌株和25％的保加利亚乳杆菌菌株，优选菌株dsm26419。在43℃下进行发酵直至ph 4.60，随后冷却到6℃并在6℃下储存7天。储存后，借助装有钻孔圆片的棒轻轻地搅拌发酵乳直至样品均匀。样品的剪切应力在流变仪(anton paar physica rheometer with asc,automatic sample changer,antongmbh,austria)上在13℃使用以下设置进行评估：

120、-等待时间(重建到某种原始结构)

121、-5分钟无振荡或旋转

122、-旋转(以300s-1测量剪切应力等)

123、-和

124、210s内21个测量点(每10s一个)上升到300s-1，且210s 21个测量点(每10s一个)下降到0.2707s-1。对于数据分析，选择了剪切速率300s-1时的剪切应力。

125、在本上下文中，术语“相同或相似的粘度特性”应理解为从低于dsm22933的粘度特性10％到高于dsm22933的粘度特性10％的范围，该范围也可以低于/高于dsm22933的粘度特性9％，例如低于/高于dsm22933的粘度特性8％，例如低于/高于dsm22933的粘度特性7％，例如低于/高于dsm22933的粘度特性6％，例如低于/高于dsm22933的粘度特性5％，例如低于/高于dsm22933的粘度特性4％，例如低于/高于dsm22933的粘度特性3％，例如低于/高于dsm22933的粘度特性2％或低于/高于dsm22933的粘度特性1％。dsm22933的粘度特性如本文和/或实施例2至实施例3中所述的进行测量。例如，粘度特性可以使用移液管粘度测试来测量，即确定从特定容量移液管流出的时间。流出时间越长，粘度越高。例如，移液管粘度测试可以按如下方式进行：

126、将200ml接种了1％的待测细菌菌株(来自在37℃脱脂乳中生长的过夜培养物)的脱脂乳制成凝乳，并在42℃或37℃孵育20h。凝乳的粘度用25ml容量移液管测量，其中重复测量所述凝乳从移液管的流出时间三次。用勺子仔细搅拌凝固乳，使其均匀。然后填充25ml容量移液管，并测量在重力作用下移液管排空的时间。从移液管中排空25ml凝乳所需的时间以秒为单位记录。

127、移液管粘度测试可以用菌株本身(单一菌株，例如实施例2)或用嗜热链球菌和酸化保加利亚乳杆菌菌株优选菌株dsm19251的混合培养物，以及任选地用1％酵母提取物(例如实施例3)进行。

128、在上文中，“特性”中应按定义部分的上下文理解，定义部分中说明了如何适当测量剪切应力或粘度。用于确定发酵产品如乳制品质构的方法包括测量发酵产品的剪切应力或粘度特性，并且在所属领域容易获得且是已知的，并且在本文中有举例说明。

129、在一个实施方案中，本发明的嗜热链球菌菌株具有如上所述的改善的质构化性质，同时保持其亲本(母体)菌株的生长性质和酸化性质。

130、包含嗜热链球菌菌株的组合物

131、本发明还提供包含如上所述的本发明嗜热链球菌菌株的组合物和发酵剂。

132、乳酸菌(lab)(包括嗜热链球菌的种的细菌)通常以便于批量发酵剂繁殖的冷冻(f-)或冻干(fd-)培养物或所谓的“直投式发酵剂(direct vat set)”培养物供应给乳品行业，旨在直接接种到发酵容器或缸中以生产乳制品，例如发酵乳制品。这种乳酸菌培养物通常称为“发酵剂(starter cultures)”或“发酵剂(starters)”。因此，本发明还提供发酵剂(starter culture或starter)，优选酸奶发酵剂，其包括如上所述的本发明的菌株。本发明的组合物或发酵剂可以是冷冻的或冻干的。此外，本发明的组合物或发酵剂可以以液体形式提供。因此，在一个实施方案中，组合物是冷冻、干燥、冻干或液体形式。优选地，本发明的组合物或发酵剂是冷冻、喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、风干、托盘干燥或液体形式。

133、本发明的组合物或发酵剂还可以另外包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、营养物、填充剂、香料或其混合物。组合物优选包含一种或更多种冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂和/或营养物，更优选冷冻保护剂、冻干保护剂和/或抗氧化剂，且最优选冷冻保护剂或冻干保护剂，或两者。保护剂如冷冻保护剂和冻干保护剂的使用是所属领域的技术人员已知的。合适的冷冻保护剂或冻干保护剂包括单糖、二糖、三糖和多糖(例如葡萄糖、甘露糖、木糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖糊精、淀粉和阿拉伯树胶(金合欢胶)等)、多元醇(例如赤藓糖醇、甘油、肌醇、甘露醇、山梨醇、苏糖醇、木糖醇等)、氨基酸(例如脯氨酸、谷氨酸)、复杂物质(例如脱脂乳、蛋白胨、明胶、酵母提取物)和无机化合物(例如三聚磷酸钠)。

134、在一个实施方案中，根据本发明的组合物或发酵剂可包含选自由以下组成的组的一种或更多种冷冻保护剂：肌苷-5'-单磷酸(imp)、腺苷-5'-单磷酸(amp)、鸟苷-5'-单磷酸(gmp)、尿苷-5'-单磷酸(ump)、胞苷-5'-单磷酸(cmp)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、次黄嘧啶、乳清苷、胸苷、肌苷和任何此类化合物的衍生物。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸、柠檬酸及其盐、没食子酸盐、半胱氨酸、山梨醇、甘露醇、麦芽糖。合适的营养素包括糖、氨基酸、脂肪酸、矿物质、微量元素、维生素(如维生素b族、维生素c)。组合物可以任选地包含另外的物质，包括填充剂(如乳糖、麦芽糖糊精)和/或香料。在本发明的一个实施方案中，冷冻保护剂是一种剂或多种剂的混合物，除了冷冻保护性之外，其具有增强效应。

135、表述“增强效应”用于描述这样的情况，其中当将冷冻保护剂接种到待发酵或转化的培养基中时，冷冻保护剂赋予解冻或重构的培养物增加的代谢活性(增强效应)。活力和代谢活性并非同义概念。商业性冷冻培养物或冻干培养物可保持其活力，但是它们可能失去了其很大一部分代谢活性，例如，即使保存时间较短，培养物也可能失去其产酸(酸化)活性。因此，活力和增强效应必须通过不同的测定来评价。其中活力通过活力测定(如测定集落形成单位)进行评估，增强效应通过相对于培养物的活力量化解冻或重构培养物的相关代谢活性进行评估。术语“代谢活性”是指培养物的除氧活性、其产酸活性，即产生例如乳酸、乙酸、甲酸和/或丙酸，或其产生代谢产物的活性，例如产生芳香化合物如乙醛、(α-乙酰乳酸、乙偶姻、二乙酰和2,3-丁二醇)。

136、在一个实施方案中，本发明的组合物或发酵剂含有或包含以材料的％w/w计0.2％至20％的冷冻保护剂或剂混合物。然而，优选按重量以0.2％至15％、0.2％至10％、0.5％至7％和1％至6％范围内的量添加冷冻保护剂或剂混合物，包括按重量以冷冻材料的％w/w计2％至5％范围内的冷冻保护剂或剂混合物。在一个实施方案中，培养物包含按重量以材料的％w/w计约3％的冷冻保护剂或剂混合物。大约3％的冷冻保护剂的量对应于100mm范围内的浓度。应当认识到，对于本发明实施方案的每个方面，范围可为所述范围的增量。

137、在另一方面，本发明的组合物或发酵剂含有或包含铵盐(例如有机酸的铵盐(例如甲酸铵和柠檬酸铵)或无机酸的铵盐)作为细菌细胞的增强剂(例如生长增强剂或酸化增强剂)，所述细菌细胞例如属于嗜热链球菌的种的细胞，例如(基本上)脲酶阴性细菌细胞。术语“铵盐”、“甲酸铵”等应理解为盐的来源或离子的组合。术语例如“甲酸铵”或“铵盐”的“来源”是指当添加到细胞培养物中时提供甲酸铵或铵盐的化合物或化合物混合物。在一些实施方案中，铵源将铵释放到生长培养基中，而在其他实施方案中，铵源代谢以产生铵。在一些优选的实施方案中，铵源是外源性的。在一些特别优选的实施方案中，铵不是由乳基质提供的。当然应当理解，可以添加氨而不是铵盐。因此，术语铵盐包括氨(nh3)、nh4oh、nh4+等。

138、在一个实施方案中，本发明的组合物可以包含增稠剂和/或稳定剂，例如果胶(例如hm果胶、lm果胶)、明胶、cmc、大豆纤维/大豆聚合物、淀粉、改性淀粉、角叉菜胶、藻酸盐和瓜尔胶。

139、本发明的组合物或发酵剂可以是混合物或成套试剂盒，其包含：

140、i)本发明的嗜热链球菌菌株，优选dsm22933菌株，以及

141、ii)属于德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii subspbulgaricus)的菌株。

142、为了获得产品(如乳制品，如酸奶)的酸度、味道、质构的最佳组合，通常使用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的组合。

143、在一个实施方案中，混合物或成套试剂盒可包含本发明的嗜热链球菌菌株与一种或更多种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和任选地一种或更多种嗜热链球菌菌株的组合。

144、例如，混合物或成套试剂盒可包含本发明的嗜热链球菌菌株与德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株dsm19251的组合。在一个实施方案中，混合物或成套试剂盒可包含嗜热链球菌菌株dsm22933与德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株dsm19251的组合。

145、此外，本发明的组合物还可包含酵母提取物。因此，本发明的组合物可包含本发明的嗜热链球菌菌株、属于德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株(优选如上所述的)、任选的其他嗜热链球菌菌株(优选如上所述的)和任选的酵母提取物。

146、词语“混合物”是指嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株被物理混合在一起。在一个实施方案中，嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在同一盒子或同一小袋中。

147、相比之下，包含嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的词语“成套试剂盒”是指嗜热链球菌菌株的培养物和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株培养物是物理分离的，但意图一起使用。因此，嗜热链球菌菌株的培养物和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株培养物在不同的盒子或密封小袋中。在实施方案中，嗜热链球菌菌株和保加利亚乳杆菌菌株的培养物处于相同的形式，即处于冷冻形式、以颗粒或冷冻颗粒的形式、粉末形式，例如干燥或冻干粉末。

148、在本发明的一个实施方案中，组合物包含104cfu(菌落形成单位)/g至1012cfu/g的嗜热链球菌菌株，如105cfu/g至1011cfu/g，如106cfu/g至1010cfu/g，或如107cfu/g至109cfu/g的嗜热链球菌菌株。在一个实施方案中，组合物还包含104cfu/g至1012cfu/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，如105cfu/g至1011cfu/g，如106cfu/g至1010cfu/g，或如107cfu/g至109cfu/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。

149、生产发酵食品的方法

150、本发明还涉及生产发酵食品的方法，其包括至少一个阶段，其中使用了至少一种本发明第一方面中所述的嗜热链球菌菌株和/或本发明第二方面中所述的组合物或发酵剂。食品的生产是通过所属领域技术人员已知的方法进行的。

151、根据要生产的产品，基质可以是乳基质。当发酵乳制品如酸奶、酪乳或开菲尔是终产品时，特别优选乳基质。因此，在一个实施方案中，该方法包括在其任一实施方案中使用如本发明的第一方面中所述的菌株和/或如本发明的第二方面中所述的组合物发酵乳基质。

152、因此，本发明提供包含根据本发明的菌株和/或组合物的食品。优选地，食品是乳制品，并且在其任一实施方案中的方法包括用至少一种根据本发明的嗜热链球菌和/或用根据本发明的组合物或发酵剂发酵乳基质(在本发明的上下文中也称为“乳基”)。

153、根据本发明的食品可以有利地还包含“增稠剂”和/或“稳定剂”，例如果胶(例如hm果胶、lm果胶)、明胶、cmc、大豆纤维/大豆聚合物、淀粉、改性淀粉、角叉菜胶、藻酸盐和瓜尔胶。

154、在一个实施方案中，食品是乳制品，如上所述。在本发明的特定实施方案中，发酵乳制品选自由以下组成的组：酸奶、马苏里拉奶酪、开菲尔、酸奶油、奶酪、夸克。特别优选酸奶。在本发明的一个实施方案中，发酵乳制品含有选自由以下组成的组的又一类食品：果汁饮料、谷类产品、发酵谷类制品、化学酸化谷类制品、豆奶制品、发酵豆奶制品及其任何混合物。

155、在一个实施方案中，发酵产品还包含选自由以下组成的组的成分：水果浓缩物、糖浆、益生菌菌株或培养物、着色剂、增稠剂、调味剂、防腐剂及其混合物。

156、同样，可以在发酵之前、期间和/或之后将酶添加到基质例如乳基质中，该酶选自由以下组成的组：能够交联蛋白质的酶、转谷氨酰胺酶、天冬氨酸蛋白酶、凝乳酶、皱胃酶及其组合。在一个实施方案中，发酵产品可以是搅拌型产品、凝固型产品或可饮用产品的形式。

157、发酵乳制品通常含有1.0％至12.0％(按重量计)，优选2.0％至10.0％(按重量计)水平的蛋白质。在特定的实施方案中，酸奶油含有1.0％至5.0％(按重量计)，优选2.0％至4.0％(按重量计)水平的蛋白质。在特定的实施方案中，夸克含有4.0％至12.0％(按重量计)，优选5.0％至10.0％(按重量计)水平的蛋白质。

158、优选地，与用不包括使用本发明所述的至少一种嗜热链球菌菌株和/或使用根据本发明的组合物或发酵剂的可比较方法生产的食品相比，该食品具有某种质构(如本发明所述,例如实施例2至实施例5中)。

159、通过本发明方法直接获得的发酵食品

160、在一个实施方案，本发明还涉及通过本发明的方法直接获得的或包含根据本发明的嗜热链球菌菌株或包含根据本发明的组合物的发酵食品。因此，本发明的一个方面也是包含本发明的嗜热链球菌菌株和/或本发明的组合物的发酵产品。发酵产品可优选乳制品，如酸奶。

161、根据本发明的制造嗜热链球菌菌株的方法

162、本发明提供了制造根据本发明的嗜热链球菌菌株和/或组合物的方法，其中该方法包括以下步骤:

163、(ⅰ)提供乳酸菌菌株作为母本菌株；

164、(ⅱ)将母本菌株暴露于任何诱变处理，包括用化学诱变剂或uv光处理，和/或对母本菌株进行本文所述的定点诱变；

165、(ⅲ)筛选包含以下突变中的至少一种、优选两种且更优选所有三种的突变菌株：

166、a)支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因中的突变；

167、b)abc转运体透性酶蛋白基因中的突变；和/或

168、c)肽脱甲酰酶蛋白基因中的突变，

169、其中，优选地，与母本菌株相比，突变菌株显示出本文所述的改善的质构化性质；且更优选地，与菌株dsm22933相比，所获得的嗜热链球菌菌株显示出本文所述的相同或改善的质构化性质。因此，本发明的方法可包括进一步的筛选步骤(ⅳ)，即筛选出突变菌株，与母本菌株相比，该突变菌株在用于发酵乳时，显示出本文所述的改善的质构化性质(例如，可产生比母本菌株更高的剪切应力和/或粘度)。

170、优选地，(ⅰ)中的母本菌株是保藏菌株dsm22587。

171、本发明中所定义的嗜热链球菌菌株也可以通过定点诱变产生，见上述步骤(ⅱ)。使用在支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)和/或abc转运体透性酶蛋白和/或肽脱甲酰酶蛋白中携带突变核苷酸的寡核苷酸，通过pcr扩增特定的dna片段。将携带所需突变的pcr片段克隆到载体质粒中，并转化到嗜热链球菌靶菌株中，并通过重组将突变整合到染色体中并交换野生型蛋白质区域。菌株分离按上述方法进行。因此，上述步骤(ⅲ)也可以筛选在以下位置包含以下氨基酸和/或核苷酸中的至少一种、优选两种且更优选全部三种的突变株:

172、a)在对应于seq id no.:12的位置169的位置处的缬氨酸和/或在对应于seq idno.:11的位置506的位置处的t(支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因)；

173、b)在对应于seq id no.:4的位置190的位置处的苯丙氨酸和/或在对应于seq idno.:3的位置568的位置处的t(abc转运体透性酶蛋白基因)；和/或

174、c)在对应于seq id no.:8的位置144的位置处的半胱氨酸和/或在对应于seq idno.:7的位置430的位置处的t(肽脱甲酰基酶蛋白基因)。

175、在一个实施方案中，支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因(a)突变是在对应于seq id no.:12的位置169的位置处谷氨酸对缬氨酸的取代和/或在对应于seq id no.:11的位置506的位置处核苷酸a对核苷酸t的突变。在一个实施方案中，abc转运体透性酶蛋白基因(b)突变是在对应于seq id no.:4的位置190的位置处亮氨酸对苯丙氨酸的取代和/或在对应于seq id no.:3的位置568的位置处核苷酸c对核苷酸t的突变。在另一优选实施方案中，肽脱甲酰酶蛋白基因(c)突变是在对应于seq id no.:8的位置144的位置处精氨酸对半胱氨酸的取代和/或在对应于seq id no.:7的位置430的位置处核苷酸c对核苷酸t的突变。

176、此外，本发明提供了用于制造嗜热链球菌菌株的方法，该菌株与母本菌株相比，在将细菌用于发酵乳时显示出改善的质构化性质(例如，产生比母本菌株更高的剪切应力和/或粘度)，包括以下步骤：

177、a)提供乳酸菌菌株作为母本菌株；

178、b)将母本菌株暴露于能够裂解母本菌株的噬菌体；

179、c)分离母本菌株的突变株，该突变株未被噬菌体裂解并且具有选自由以下组成的组的一种、两种或三种突变：

180、i.支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因中的突变；

181、ii.abc转运体透性酶蛋白基因中的突变；和/或

182、iii.肽脱甲酰酶蛋白基因中的突变；和

183、e)筛选突变株，与母本菌株相比，该突变株在用于发酵乳时，显示出本文所述的改善的质构化性质(例如，产生比母本菌株更高的剪切应力和/或粘度)。优选地，如上所述的本发明方法包括在如上所述步骤c)之前将暴露的细菌细胞在生长培养基中孵育的步骤。优选地，母本菌株是菌株dsm22587。优选地，能够裂解以上步骤b)的母本菌株的噬菌体是dsm24022。

184、在一个实施方案中，(i)支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因中的突变是在对应于seq id no.:12的位置169的位置处谷氨酸对缬氨酸的取代和/或在对应于seq id no.:11的位置506的位置处核苷酸a对核苷酸t的突变。在一个实施方案中，abc转运体透性酶蛋白基因中的突变是在对应于seq id no.:4的位置190的位置处亮氨酸对苯丙氨酸的取代和/或在对应于seq id no.:3的位置568的位置处核苷酸c对核苷酸t的突变。在一个实施方案中，肽脱甲酰酶蛋白基因中的突变是在对应于seq id no.:8的位置144的位置处精氨酸对半胱氨酸的取代和/或在对应于seq id no.:7的位置430的位置处核苷酸c对核苷酸t的突变。

185、上述步骤d)还可以包括在引入下列位置的以下氨基酸/核苷酸中的至少一种、优选两种且更优选全部三种：

186、a)在对应于seq id no.:12的位置169的位置处的缬氨酸和/或在对应于seq idno.:11(支链氨基酸转运atp结合蛋白livg(tc 3.a.1.4.1)基因)的位置506的位置处的t；

187、b)在对应于seq id no.:4的位置190的位置处的苯丙氨酸和/或在对应于seq idno.:3(abc转运体透性酶蛋白基因)的位置568的位置处的t；和/或

188、c)在对应于seq id no.:8的位置144的位置处的半胱氨酸和/或在对应于seq idno.:7(肽脱甲酰基酶蛋白基因)的位置430的位置处的t。

189、上述步骤d)(例如，引入所述突变的至少一种、优选两种且更优选所有三种)可以通过将母本菌株暴露于任何常规使用的诱变处理来进行，包括用化学诱变剂或uv光处理和/或通过本文所述的定点诱变。

190、用于确定发酵产品如乳制品质构的方法包括测量发酵产品的剪切应力或粘度(例如，用本文所述的移液管粘度测试)，并且在所属领域容易获得且是已知的，并且在本文被描述和例示。

191、在一个实施方案中，本发明的嗜热链球菌菌株和/或通过上述方法直接获得的嗜热链球菌菌株产生的剪切应力与其母本菌株相比提高了至少1％，例如与其母本菌株相比提高了2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多。本发明的嗜热链球菌菌株和/或通过上述方法直接获得的嗜热链球菌菌株的剪切应力特性可在混合培养物中进行测量，如实施例5中所述。此外，dsm2293的剪切应力特性可以如上所述通过菌株本身来测量。

192、在一个实施方案中，当以0.02％ fd-dvs发酵剂的量接种时，当在乳(3.6％蛋白质和1.5％或3％脂肪)中在43℃生长不到5小时(直到ph为约4.60)后，本发明的嗜热链球菌菌株和/或通过上述方法直接获得的嗜热链球菌菌株产生的剪切应力以300 1/s(pa)测量与其母本菌株相比提高了至少1％，例如与其母本菌株相比提高了2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多。

193、在一个实施方案中，用本发明的嗜热链球菌菌株和/或通过上述方法直接获得的嗜热链球菌菌株凝固的乳产生的从移液管的流出时间与其母本菌株相比提高了至少1％，例如与其母本菌株相比提高了2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多。移液管粘度测试可以如实施例2中所述进行。移液管粘度测试可以作为混合培养物进行，如实施例3中所述。

194、所谓“质构”或“口感”是指产品在口腔中的物理和化学相互作用。

195、本发明的嗜热链球菌菌株和/或本发明的组合物的用途

196、本发明的一个方面涉及本发明的嗜热链球菌菌株和/或组合物来制造发酵产品的用途。同样，发酵产品可以是乳制品。

197、除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，本发明涵盖上述要素、方面和实施方案的所有可能的变化的任何组合。下面仅以举例的方式描述本发明的实施方案。

198、实施例

199、实施例1：嗜热链球菌菌株dsm22587的噬菌体抗性突变体

200、将0.1ml的dsm22587的m17-2％乳糖过夜培养物与0.1ml的每ml含有1×108个噬菌体颗粒的噬菌体dsm24022一起平铺在含有10mm mgcl2/cacl2的m17-2％乳糖琼脂平板上，并在37℃孵育过夜后，产生来自母本菌株dsm22587的噬菌体抗性突变体。在几个突变体中，菌株dsm22933经过三次菌落纯化，并在37℃的m17乳糖琼脂平板上用噬菌体dsm24022进行噬菌体攻击，在菌斑中重新测试，并确认了噬菌体抗性(在菌斑测试中未观察到单个的菌斑)。还在乳酸化试验中测试了dsm22933，显示出与母本菌株相当的酸化活性。

201、dsm22933的基因组如et al.,2018所述在chr.hansen a/s进行测序。简而言之，将总dna纯化，并使用illumina miseq系统制备一个250bp的双端文库，用于基因组测序。对序列读长进行了质量裁剪(phred评分＜25)，并利用clc genomics workbench10.1.1版(clc bio,qiagen bioinformatics)中的从头组装算法将其组装成重叠群。通过删除覆盖率＜15x和/或组装中位覆盖率＜20％的重叠群来过滤所得基因组组件。剩余重叠群的共有序列以fasta格式输出，其称为基因组序列草图，并用于随后的序列分析。

202、表1.与其母本菌株dsm22587相比，在dsm22933中鉴定的突变。

203、

204、实施例2：dsm22933作为单一菌株的移液管粘度测试

205、通过移液管测试测量粘度。在该测试中，测定了从特定容量移液管流出的时间。流出时间越长，粘度越高。将200ml接种了1％的待测细菌菌株(来自在37℃脱脂乳中生长的过夜培养物)的脱脂乳制成凝乳，并在42℃下孵育20h。凝乳的粘度用25ml容量移液管测量，其中重复测量所述凝乳从移液管的流出时间三次。用勺子仔细搅拌凝固乳，使其均匀。然后填充25ml容量移液管，并测量在重力作用下排空移液管的时间。从移液管中排空25ml凝乳所需的时间以秒为单位记录。

206、dsm22933提供了比其母本菌株dsm22587更高的粘度，因为如下表所示其使通过移液管测试测量的流出时间增加了25％。

207、表2.dsm22933与其母本菌株dsm22587相比的移液管粘度测试结果。

208、

209、实施例3：dsm22933在混合培养物中的移液管粘度测试。

210、移液管测试如实施例2所述进行，不同之处在于过夜培养和最终孵育均在37℃进行。用0.9％ dsm22933或dsm22587、0.1％德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株dsm19251和1.0％酵母提取物的混合培养物发酵，使其达到最终ph 3.8。

211、本发明的菌株dsm22933在与保加利亚乳杆菌菌株dsm19251和酵母的混合培养物中也显示出改善的粘度，如下表所示。

212、表3.混合培养物中dsm22933的移液管粘度测试结果。

213、

214、实施例4：用dsm22933制作的迷你酸奶的抽吸。

215、迷你酸奶是由含有4.0％蛋白质和0.1％脂肪的乳基接种0.02％的f-dvs发酵剂制成的。将dsm22933和dsm24023分别加入22种不同的混合培养物中进行比较以评价这些菌株的质构化性质。22种混合培养物均由嗜热链球菌菌株和保加利亚乳杆菌菌株的不同组合组成。测量抽吸以检查增加的质构。抽吸越负，迷你酸奶的质构越好。这两个菌株(dsm22933和dsm24023)是来自同一母本菌株dsm22587的姊妹菌株。dsm24023不包含上表1中所述的dsm22933的三个突变。

216、与包含dsm24023的培养物(-1692pa)相比，在观察22种迷你酸奶的平均值时，包含dsm22933的培养物需要更高的压力来抽吸酸奶(-1808pa)。

217、实施例5：用dsm22933制成的酸奶的流变特性。

218、用0.02％ fd-dvs发酵剂分别接种含有3.6％蛋白质和3％脂肪的乳基1(mb1)或含有3.6％蛋白质和1.5％脂肪的乳基2(mb2)。在43℃下发酵到ph 4.60。将凝固型酸奶在6℃下储存7天。流变特性剪切应力是在流变仪上在13℃测量的，流变仪(anton paar physicarheometer with asc,automatic sample changer,antongmbh,austria)使用下列设置：

219、-等待时间(重建到某种原始结构)

220、-5分钟无振荡或旋转

221、-旋转(以300s-1等测量剪切应力)

222、-和

223、210s内21个测量点(每10s一个)上升到300s-1且210s内21个测量点(每10s一个)下降到0.2707s-1。对于数据分析，选择了剪切速率300s-1下的剪切应力。

224、将使用dsm22933的培养物进行的发酵与使用没有上表1所述突变的现有技术菌株dsm22589的基准培养物进行的发酵进行比较。两种培养物均包含在两种培养物中相同的另一种嗜热链球菌菌株和一种非质构化保加利亚乳杆菌菌株。

225、与基准相比，包含dsm22933的培养物显示出改善的粘度，如下面的两个表所示。，获得了使用30％ dsm22933与50％ dsm22589相比的结果。

226、表4.用乳基1和dsm22933制成的酸奶的流变特性。

227、 mb1 <![cdata[30s^-1的剪切应力(pa)]]> <![cdata[300s^-1的剪切应力(pa)]]> 基准 53 53 用dsm22933培养 65 59

228、表5.用乳基2和dsm22933制成的酸奶的流变特性。

229、 mb2 <![cdata[30s^-1的剪切应力(pa)]]> <![cdata[300s^-1的剪切应力(pa)]]> 基准 44 44 用dsm22933培养 49 48

230、保藏和专家解决方案

231、申请人要求，下表中指出的保藏微生物样品只能提供给申请人认可的专家。

232、表6.在根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约》获得国际保藏机构地位的保藏机构进行的保藏：莱布尼茨dsmz研究所-德国微生物保藏中心，德国布伦瑞克因霍芬街7b,d-38124。

233、 微生物 登录号 保藏日期 嗜热链球菌 dsm 22933 2009.09.08

234、表7.其他微生物的引用

235、 其他微生物 登录号 引用 嗜热链球菌 dsm22587 wo2011/026863 嗜热链球菌 dsm22589 wo2007/095958 嗜热链球菌 dsm24023 wo2011/092300 德氏乳杆菌保加利亚亚种 dsm19251 wo2011/026863 噬菌体 dsm24022 wo2011/092300

236、参考文献

237、et al.，(2018)

238、broadbent et al.(2003)j.dairy sci.，86：407-423

239、emboss：the european molecular biology open software suite，rice et al.(2000)trends in genetics 16：276-277

240、needleman and wunsch(1970)j.mol.25biol.48：443-453。