调控玉米株高和响应高温胁迫相关的蛋白ZmCLF及其应用

本发明涉及生物中调控玉米株高和响应高温胁迫相关的蛋白zmclf及其应用。

背景技术：

1、近些年来，随着全球人口数量的持续增长和耕地面积的不断减少，粮食安全已经成为困扰许多国家的重大问题(hochholdinger,yu et al.2018)，而玉米(zea mays l.)作为世界上粮食总产量最高的农作物，既是粮食作物同时也是重要的饲料作物，具有饲用、食用、制备酒精等多种工业用途(fang,bo et al.2021)，提高玉米平均产量对于保障粮食安全具有十分重要的生物学意义，因此玉米的生长发育调控和遗传育种研究一直是基础研究的重中之重(hake and ross-ibarra 2015,hochholdinger 2016)。近些年来关于玉米发育基因的研究层出不穷，特别是在玉米株型发育方面，例如，zmrph1基因过表达可以通过调节微管相关蛋白，从而造成植株细胞的长度减少但宽度增加，最终导致玉米幼苗根变短，细胞长度减少高度降低，玉米植株变矮(li,ge et al.2020)。zmte1基因敲除后通过调控玉米闰间分生组织(成熟组织区域之间发育的分生组织)的形成以及节间细胞来影响玉米株高(wang,yu et al.2022)。zmga3ox2基因通过调控内源性赤霉素的合成及分解和节间长度，从而影响玉米植株高度和分枝结构(teng,zhai et al.2013)。zmdwf1基因是一个正向调控基因，调控参与细胞壁相关代谢和激素代谢(包括br、赤霉素和生长素的表达水平)基因，进而影响玉米叶夹角的大小(cao,dou et al.2022)。zmcla4基因通过改变mrna的积累，可以调节地上部的向重力性从而改变iaa(吲哚乙酸)在枝条中的分布，随后改变对芽的向重性以及细的分裂和发育，在玉米叶夹角的控制中起负向作用(即过表达导致叶夹角变小)(zhang,ku et al.2014)。zmibh1-1是一个负调控基因(即zmibh1-1导致玉米叶夹角变大)可直接调控参与细胞壁修饰、细胞发育和激素反应(如生长素和油菜素类固醇)的基因，这导致叶片韧状区域的细胞壁木质化和细胞大小的改变，从而导致玉米叶夹角的变化(cao,zeng et al.2020)。zmnac111过表达可以促进玉米根系的发育和生长，表现出更高的根冠比、光合作用速率和抗氧化酶活性提高、开花-吐丝间隔更短，使得玉米植株可以更好的抵抗干旱等逆境因素，从而提高玉米的产量(liu,liu et al.2022)。pyr1/pyl8受体可以调控根部aba的信号转导，突变体显示出aba介导的根系生长抑制减少从而影响玉米根部的生长发育，促进根部生长(antoni,gonzalez-guzman et al.2013)。过表达的zmipt2基因通过调控细胞分裂素的合成，从而降低玉米叶片的衰老速度进而造成玉米穗长、穗厚、粒长、粒宽和籽厚显著增加，提高玉米籽粒质量和产量(song,li et al.2022)。过表达的zmpx5基因通过增强过氧化物酶的活性，从而提高玉米植株对真菌和昆虫的抗性(dowd and johnson2016)。zmwrky83转录因子可以调控玉米植株次生代谢物生物合成即相关蛋白质的上调来抵抗禾谷镰刀菌的感染(bai,si et al.2021)。zmers4基因可以编码类似于乙烯受体的蛋白质，过表达zmers4可以提高病原菌感染后的水杨酸(sa)水平，通过水杨酸(sa)信号通路参与植物防御过程并增加防御相关基因pr4基因的表达，从而提高了玉米的抗病能力(hang,ling et al.2021)。

2、除了株型发育对玉米的影响，同时全球气候变暖、极端天气频发也严重影响了玉米产量。随着部分地区人口的急剧增长和温室气体浓度的不断增加，预计今后几年气温将进一步升高，热胁迫可能成为玉米产量增加的主要制约因素之一。因此，增强玉米对高温环境的适应能力也尤为重要(slafer and roxana 2018)。近年来经过不断探索和实践，对玉米抗热研究已经有了一定的进展，例如：过表达zmsro1d基因可以增强对zmrbohc的单adp-核糖转移酶活性，增加保卫细胞中活性氧(ros)的水平促进气孔关闭，从而增强干旱条件下的玉米的抗旱能力，保护了籽粒产量(gao,cui et al.2022)。zmhsf11基因调控氧化应激相关基因的表达和活性氧(ros)水平，过表达zmhsf11可有效增强玉米的抗热能力，并增加籽粒产量(qin,zhao et al.2022)。然而玉米株型和胁迫响应的表观遗传机制研究进展缓慢。

3、表观遗传学是指在不发生dna序列变化情况下产生可遗传的基因功能变化的学科(boccaletto,stefaniak et al.2022)，作用机制主要包括rna共价修饰、染色质重塑、组蛋白修饰、dna共价修饰和非编码rna的调控等(fitz-james and cavalli 2022)。其中pcg家族在表观遗传调控中起着不可或缺的作用，pcg包括prc2和prc1两个主要的复合体，在植物发育阶段的转变中起着关键作用影响植物从种子萌发到营养生长再到生殖发育的整个发育过程(xiao and wagner 2015)。其中prc1中的clf在植物发育中更是起着非常重要的作用，例如：在拟南芥中clf可以抑制sep3的表达和诱导ora59的表达，从而使得拟南芥叶片对炭疽菌免疫(singkaravanit-ogawa,kosaka et al.2021)；同时atclf可以通过直接靶向agl17和调节h3k27me3的水平从而控制拟南芥的开花时间以及植株的大小发育(shu,chenet al.2020)；在水稻中osclf可通过减少细胞分裂和茎的扩张从而导致矮化表型，也可以通过ga途径调控水稻株高(zhong,peng et al.2018)，然而clf在玉米中的功能却尚不清楚。

4、综上所述，研究clf基因在玉米中的作用及机制十分重要，同时为揭示玉米表观遗传机制提供基础研究材料，并为优良玉米新品种的选育提供理论支撑，在分子育种上得到应用。

5、参考文献

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技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何降低玉米株高和/或提高玉米耐热性和/或抗倒性。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供降低所述蛋白质zmclf含量的物质或抑制所述蛋白质zmclf的编码基因表达的物质的应用，所述应用为下述任一种：

3、p1、在降低玉米株高中的应用；

4、p2、在提高玉米耐热性中的应用；

5、p3、在增加玉米抗倒性中的应用；

6、p4、在植物育种中的应用；

7、所述蛋白质zmclf是如下a1、a2或a3的蛋白质：

8、a1、氨基酸序列是序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列的蛋白质；

9、a2、将序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

10、a3、在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

11、上述应用中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

12、上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

13、上述应用中，所述蛋白质zmclf可来源于玉米。

14、上述应用中，所述蛋白质zmclf的编码基因为zmclf基因，可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

15、上述应用中，所述蛋白质zmclf编码基因具体可为编码链的编码序列是seq idno.1的核酸分子。所述蛋白质zmclf编码基因更具体可为序列是seq id no.3的3’端和seqidno.4的5’端连接而成的核酸分子。

16、上述应用中，所述降低所述蛋白质zmclf含量或所述抑制或降低所述蛋白质zmclf的编码基因表达，可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

17、所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。

18、所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活,包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。

19、上述应用中，所述降低所述蛋白质zmclf含量的物质或抑制所述蛋白质zmclf编码基因表达的物质可为敲除所述蛋白质zmclf的编码基因的试剂，如通过同源重组敲除所述zmclf编码基因的试剂，或通过crispr-cas9敲除所述zmclf编码基因的试剂。所述通过crispr-cas9敲除所述zmclf编码基因的试剂含有下述f1)、f2)或f3)：

20、f1)靶向所述zmclf的编码基因的sgrna；

21、f2)产生靶向所述zmclf的编码基因的sgrna的dna分子；

22、f3)产生靶向所述zmclf的编码基因的sgrna的表达载体。

23、上述应用中，所述sgrna的靶序列为seq id no.4的第936-958位和seq id no.4的第1081-1103位。

24、为解决上述技术问题，本发明还提供了一种降低玉米株高的方法，包括抑制受体玉米中所述蛋白质zmclf的编码基因的表达，得到玉米株高低于所述受体玉米的玉米的步骤；所述受体玉米为含有所述编码基因的玉米。

25、本发明还提供了一种提高玉米耐热性的方法，包括抑制受体玉米中所述蛋白质zmclf的编码基因的表达，得到玉米耐热性高于所述受体玉米的玉米的步骤；所述受体玉米为含有所述编码基因的玉米。

26、本发明还提供了一种提高玉米抗倒性的方法，包括抑制受体玉米中所述蛋白质zmclf的编码基因的表达，得到玉米抗倒性高于所述受体玉米的玉米的步骤；所述受体玉米为含有所述编码基因的玉米。

27、上述方法中，所述抑制受体玉米中所述蛋白质zmclf的编码基因的表达是通过对所述受体玉米中所述蛋白质zmclf的编码基因进行基因编辑实现的。所述基因编辑是借助crispr/cas9系统实现的。

28、上述方法中，所述crispr/cas9系统包括表达含有cas9和sgrna的质粒，所述sgrna的靶序列可为seq id no.4的第936-958位和seq id no.4的第1081-1103位。

29、上述方法中，所述sgrna的核苷酸序列如序列表中seq id no.5所示。

30、本发明还提高所述蛋白质zmclf和与所述蛋白质zmclf的编码基因。

31、本技术中，所述提高玉米耐热性可体现为热胁迫下玉米成活率增加和/或玉米植株中h3k27me3的含量增加。

32、本技术中，所述提高玉米抗倒性可体现为玉米株高变矮和/或穗位高度变低和/或节间距变短。

33、经实验证实，zmclf与已报道的拟南芥和水稻中clf蛋白高度同源。敲除玉米中zmclf的编码基因的得到zmclf纯合突变株系，经过野生型和zmclf纯合突变体植株的表型分析和热胁迫下表型分析，发现与野生型相比，zmclf纯合突变株系株高变矮，且表现出显著的抗热胁迫的表型，说明该基因在玉米株高调控、抗热胁迫调控、抗倒性调控中起着重要的作用。对该基因的研究可以进一步丰富表观遗传在作物中的应用，对玉米株高、耐热性和抗倒性的改良具有重要的意义。