一种具有漆酶样催化活性的人工酶及制备方法和应用

本发明涉及一种以n-苄氧羰基-l-组氨酸与乙酸铜为原料通过配位作用自组装获得具有漆酶活性的人工酶的制备方法和应用，属于人工酶制备及其应用，具体是一种具有漆酶样催化活性的人工酶及制备方法和应用。

背景技术：

1、多环芳烃和苯酚及其衍生物是不可降解的环境污染物，在土壤和废水中广泛分布，严重破坏自然环境，危害人体健康。漆酶是一种多铜氧化酶，可对广泛范围内的污染物进行单电子氧化，因此被认为是一种绿色催化剂，是降解酚类和多环芳烃等在内的化学污染物的有效手段。然而，天然漆酶的生产成本较高，催化活力受环境条件影响较大，且其稳定性较差，限制了大规模的应用。天然漆酶的固定化和制造人工漆酶是应对这一问题的常见选择。人工漆酶制造通过模仿天然漆酶的活性中心或结构，人为合成具有漆酶活性的人工酶，相比于天然漆酶，人工酶往往具有优良的操作稳定性和环境耐受性，且便于回收使用，成为了当前研究开发的热点。

2、漆酶的催化行为由其结构中的四个铜原子来执行，铜原子根据吸收光谱和电子顺磁性质分为三类：一个i型(t1)蓝色顺磁性铜、一个ii型(t2)非蓝色顺磁性铜和两个iii型(t3)自旋偶联的抗磁性cu-cu对。在催化反应中，t1首先接受底物电子，随后通过cys–his途径将电子转移到由t2和t3组成的三核铜簇，分子氧被还原为水。t1铜的电子转移决定了催化反应的速率。基于漆酶催化活性中心的由铜组成的电子传递链，目前，已开发金属有机框架、碳点、无机纳米材料、肽和氨基酸等构建人工漆酶。

3、氨基酸凭借良好的生物相容性及其作为天然酶组成单元的优势成为了模拟酶的优异构建材料，他们含有非共价键供体或受体，可以通过分子间或分子内自组装拉近并定向官能团，形成催化腔。在人工漆酶领域，以色列gazit课题组将苯丙氨酸与铜离子自组装得到漆酶模拟酶(nature catalysis,2019,2,977-985)、将非天然氨基酸γ-羧基谷氨酸与铜离子组装得到高性能漆酶模拟酶(journal of materials chemistry a,2021,9,20385-20394)、本课题组之前使用非天然氨基酸二苯甲酮丙氨酸与cu构建了漆酶模拟酶bpa-cu(journal of hazardous materials,2023,443,2023,130198)。这些研究基于极简策略使用天然氨基酸和非天然氨基酸构建人工漆酶，但是氨基酸与金属离子通过配位作用和疏水相互作用等结合后可为催化提供的官能团十分有限，这限制了更优异的酶催化微环境的构建进而影响人工酶的催化活力和对底物的亲和力。氨基酸衍生物在氨基酸的基础上进一步引入更多官能团，可提供更丰富的官能团选择，且更易于实现官能团的富集。由此，基于氨基酸衍生物与金属离子的配位作用使用极简策略构建具有更高催化活力和能力的人工漆酶极具潜力。

技术实现思路

1、本发明使用商品化的组氨酸衍生物n-苄氧羰基-l-组氨酸(z-l-his)与乙酸铜通过极简策略在室温条件下共组装构建人工漆酶(z-l-his/cu2+)并将其应用于酚类污染物的降解和比色检测。本发明的目的在于提供一种高性能的人工漆酶及其构建方法，扩充人工漆酶研究，并进一步促进人工漆酶构建材料库和性能的发展，为酚类污染物的比色检测提供更加高性能的漆酶选择。本发明的人工漆酶制备方法简单，反应条件温和、易于操作，同时乙酸铜和z-l-his廉价易得，提供了一种经济实惠的可降解和检测酚类污染物的人工漆酶。

2、本发明的技术方案概述如下：

3、一种具有漆酶样催化活性的人工酶；由n-苄氧羰基-l-组氨酸(z-l-his)与乙酸铜构建的纳米棒状超分子材料，具有漆酶样催化活性，记为z-l-his/cu2+。

4、本发明的具有漆酶样催化活性的人工酶的制备方法，包括如下步骤：

5、1)配置乙酸铜水溶液，使用0.22μm的滤膜过滤备用，配置naoh溶液并用其配置z-l-his溶液，使用0.22μm的滤膜过滤；在室温条件下将乙酸铜溶液逐滴加入到z-l-his溶液中，将合成体系在室温下静置1-12h；

6、2)合成样品通过离心收集，使用去离子水洗涤样品3-6次，并在40-80℃的真空干燥箱中干燥。

7、所述的步骤1)乙酸铜溶液的浓度为20-50mm，氢氧化钠浓度为10-15mm，z-l-his溶液浓度为15-50mm。

8、所述的步骤1)乙酸铜溶液在室温条件下通过滴加方式加入z-l-his溶液中。

9、所述的步骤1)乙酸铜和z-l-his的摩尔比为1：0.5-2。

10、本发明的具有漆酶样催化活性的人工酶用于酚类污染物降解，包括苯酚、2-萘酚、2,4-二氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、邻苯二酚或对苯二酚的降解的应用。

11、本发明的具有漆酶样催化活性的人工酶用于酚类比色检测器，包括苯酚、2-萘酚、2,4-二氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、邻苯二酚或对苯二酚比色检测器。

12、本发明以组氨酸衍生物n-苄氧羰基-l-组氨酸(z-l-his)为原材料，z-l-his是组氨酸的氨基被苄氧羰基取代后的产物，其上含有咪唑基、羧基和仲胺等基团，是优良的金属离子配体和催化关键基团，同时含有芳环结构具有形成超分子聚集体的能力。本发明将z-l-his与乙酸铜通过自组装构建了一种具有漆酶活性的纳米棒状人工酶，以2,4-二氯苯酚(2.4-dp)为底物，4-氨基安替比林(4-ap)为显色剂测定人工漆酶的活性及稳定性。本发明构建的z-l-his/cu2+的米氏常数(km)为0.097mm，最大反应速率(vmax)为2.2×10-5mm/s，催化效率(kcat/km)为226.8×10-5l/(g·s)，展现出对2,4-dp良好的亲和力和高的催化效率。z-l-his/cu2+具有良好的温度耐受性，在广泛的温度范围内(0-80℃)孵育30min后活性未发生损失。z-l-his/cu2+展现出较好的有机溶剂和ph耐受性，且添加nacl对z-l-his/cu2+催化具有促进作用。此外，z-l-his/cu2+还具有15天内的优异的长期储存稳定性。z-l-his/cu2+具有较好的重复使用能力，在经过4次循环使用后活力未发生明显损失。值得注意的是z-l-his/cu2+对6种常见酚类污染物(2,4-dp、2-萘酚、2,4,6-三氯苯酚、邻苯二酚、对苯二酚和苯酚)都具有降解能力，展现出底物普适性。z-l-his/cu2+被开发用于酚类污染物的比色检测，对6种酚类污染物都显示出良好的线性关系(r2≥0.994)，且实验计算了z-l-his/cu2+对2,4-dp、2,4,6-三氯苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、苯酚、2-萘酚的检出限分别为117.9nm、107.6nm、195.9nm、806.0nm、804.1nm、900.7nm，低的检测限表明其用于广泛酚类污染物比色检测的强大能力。

13、本发明的优势在于本发明的制备条件简单，z-l-his的合成条件成熟且价格低廉，来源广泛。通过紫外-可见光分光光度计和酶标仪即可对人工酶的催化过程进行监测。相比于之前文献所报道的材料相比，本发明的优势在于：

14、1)所制备的人工酶具有较低的km(0.097mm)和较高的催化效率(226.8×10-5l/(g·s))；

15、2)所制备的人工酶对2,4-dp、2,4,6-三氯苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、苯酚、2-萘酚的检出限更低。