生物素标记的目的蛋白的细胞株及其构建方法与流程

本申请属于生物，具体涉及一种生物素标记的目的蛋白的细胞株及其构建方法。

背景技术：

1、生物素（biotin，b）广泛分布于动、植物组织中，分子量244.31da。生物素分子有两个环状结构，其中ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要结构；ii环为噻吩环，c2上有一戊酸侧链，末端羧基是与其他分子发生结合的结构，经化学修饰后，生物素可以成为具有多种活性基团的衍生物—活化生物素。

2、亲和素（avidin，av）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，由4个相同亚基组成，分子量为68kda。由于具有4个相同的亚基，使得生物素与亲和素之间具有极强的亲和力。并且，二者的结合稳定性好、专一性强。链霉亲和素（streptavidin，sa）分子由4条相同的肽链组成，结合生物素的活性基团是肽链中的色氨酸残基。

3、生物素连接酶（biotin ligase）由bira基因编码，能活化生物素形成生物素酰 -5'-腺苷酸，将生物素特异地转移到生物素受体标签蛋白（如avitag融合蛋白）上，使标签蛋白生物素化，也可用作生物素操纵子阻碍物。生物素蛋白连接酶广泛存在于原核生物和真核生物的体内，又可以称为生物素连接酶、生物素操纵子阻遏蛋白、生物素全酶合成酶以及羧化全酶合成酶。由于其生物素化的能力，bira酶作为一种重要的试剂已广泛用于蛋白质分子之间相互作用的研究，特别是细胞表面受体-配体相互作用的研究。

4、生物素是一种有机小分子，可与亲和素或链霉亲和素特异性紧密结合（解离常数约为10mol/l~15mol/l）。利用二者的高亲和性，将生物素标记在靶蛋白上，然后利用亲和素或链霉亲和素，对靶蛋白进行免疫检测、富集和互作蛋白分析，是常用的生物学方法之一。利用此种生物素-亲合素系统具有特异性强的亲和作用，可将蛋白质标记上生物素（即生物素化蛋白）后，可被亲和素/链霉亲和素特异性的结合，从而实现识别检测、生物大分子捕获、蛋白相互作用检测等应用。生物素化蛋白已经广泛应用于免疫学、细胞生物学和分子生物学的实验研究领域。

5、生物素标记蛋白是一种常用的蛋白质标记方法，当前存在的生物素标记法有：（1）体外标记法，将靶蛋白和ｎ-羟基琥珀亚胺酯活化的生物素混合孵育，然后透析除去未结合的生物素，从而获得生物素标记的蛋白质。该体外化学修饰法繁杂，目标蛋白的损失较大，且在一定程度上会破坏蛋白质的构象或功能，不利于后期生物学实验的进行。

6、（2）通过表达纯化可溶性的bira蛋白，并以生物素酶底物肽为底物，建立bira催化的体外生物素标记方法。该方法去除bira需一步体外蛋白酶解后的纯化，对蛋白的损失较大。

7、（3）使用双质粒共表达方法，分别瞬转表达目的蛋白和bira蛋白，实现胞内的生物标记。该方法受质粒相容性、多抗性筛选的影响，目的蛋白生物素化水平较低，表达持续时间较短，不适合大量获取。

技术实现思路

1、基于此，本申请一实施例提供一种生物素标记的目的蛋白的细胞株及其构建方法。

2、本申请一方面提供一种生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法，包括以下步骤：

3、制备生物素连接酶表达载体以及目的蛋白表达载体；以及，

4、将所述生物素连接酶表达载体与所述目的蛋白表达载体共同转染至宿主细胞，筛选，获取表达生物素标记的目的蛋白的细胞株。

5、在其中一个实施例中，所述生物素连接酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。

6、在其中一个实施例中，所述生物素连接酶表达载体包括piggybac-bira-blast、piggybac-bira-hygro和piggybac-bira-zeocin中的一种或多种。

7、在其中一个实施例中，所述目的蛋白包括her2蛋白。

8、在其中一个实施例中，所述her2蛋白表达载体包括piggybac-her2-his-avitag-puro。

9、在其中一个实施例中，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞。

10、在其中一个实施例中，所述哺乳动物细胞为293f细胞。

11、在其中一个实施例中，所述转染的转染液包括a液和b液；

12、所述a液包括：opti-mem、piggybac-bira-blast、piggybac-her2-his-avitag-puro和pb-transposase；

13、所述b液包括opti-mem和lipofectamine2000。

14、在其中一个实施例中，筛选的步骤包括：

15、加入终浓度为8μg/ml~10μg/ml杀稻瘟菌素霉素和终浓度为6μg/ml~10μg/ml的嘌呤霉素，持续筛选1周~2周。

16、本申请另一方面提供所述的生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法构建得到的生物素标记的目的蛋白的细胞株。

技术特征：

1.一种生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法，其特征在于，所述生物素连接酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法，其特征在于，所述生物素连接酶表达载体包括piggybac-bira-blast、piggybac-bira-hygro和piggybac-bira-zeocin中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法，其特征在于，所述目的蛋白包括her2蛋白。

5.根据权利要求4所述的生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法，其特征在于，所述her2蛋白表达载体包括piggybac-her2-his-avi tag-puro。

6.根据权利要求4所述的生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞。

7.根据权利要求6所述的生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为293f细胞。

8.根据权利要求1~7任一项所述的生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法，其特征在于，所述转染的转染液包括a液和b液；

9.根据权利要求1~7任一项所述的生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法，其特征在于，筛选的步骤包括：

10.由权利要求1~9所述的生物素标记的目的蛋白的细胞株的构建方法构建得到的生物素标记的目的蛋白的细胞株。

技术总结本申请属于生物技术领域，生物素标记的目的蛋白的细胞株及其构建方法。具体包括以下步骤：制备生物素连接酶表达载体以及目的蛋白表达载体，将所述生物素连接酶表达载体与所述目的蛋白表达载体共同转染至宿主细胞，筛选，获取表达生物素标记的目的蛋白的细胞株。技术研发人员：龚仕涛,邱焕杰,安文俊,林晓涛,吴力强,钱纯亘受保护的技术使用者：深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/17