一种基于磁珠法的核酸提取方法与流程

本发明涉及核酸提取，具体涉及一种基于磁珠法的核酸提取方法。

背景技术：

1、提取核酸在现代生物学研究中具有至关重要的意义。核酸包括dna和rna，是生命活动中的重要遗传物质，它们携带着生物体的遗传信息，控制蛋白质的合成，从而影响生物体的所有生理活动和特征。提取核酸能够让我们直接接触到这些遗传指令，进而对其进行深入的研究和分析。无论是在基因测序、基因表达分析、基因突变筛查，还是在疾病的早期诊断和治疗中，核酸提取都是不可或缺的一步。现有的核酸提取主要分为物理法、化学法、生物法。其中物理法又分为煮沸法、冻融法、超声波法、研磨法等。其原理是利用高温、高压、冷冻、超声波的机械效应、热效应、空化作用等破坏待检测样本的细胞结构，释放出细胞内容物，核酸分子因此得以被提取出来。这种操作方法简单易操作，但提取效率低，提取出的产物纯度低。其中化学法包括碱裂解法、苯酚-氯仿抽提法、盐析法、trizol法、碘化钾法等。化学法能够有效去除蛋白质、多糖、脂类等杂质，因此提取出的产物纯度较高。然而化学法提取过程较为繁琐，耗时较长。其中的生物法其原理是利用溶菌酶、蛋白酶k等裂解细胞，释放出细胞内容物，从而提取核酸。但此方法存在酶易失活且成本高的弊端。因此又发展出了以固相提取为代表的新式核酸提取方法，主要包括二氧化硅基质提取法、离心柱提取法、纸基提取法、磁性离子液体提取法及磁珠法。其中磁珠法是一种安全环保的核酸提取方法，其操作灵活、安全性高、产品纯度较高。但目前的磁珠法步骤较多，且需要经过多次洗涤及洗脱步骤，因此有可能会造成核酸损失及稀释，影响了核酸浓度和纯度。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提出一种基于磁珠法的核酸提取方法以解决上述问题。

2、本发明的技术方案是这样实现的：一种基于磁珠法的核酸提取方法，包括以下步骤：

3、步骤一、磁珠表面修饰：在40-60℃下将磁性微球、磷脂酰肌醇、甲醇以80-100r/min震荡混匀60-90s，向上述混合液中缓慢加入3-吗啉丙磺酸、氯化钠并将ph调节至6.8-7.2，反应25-35min，并采用无菌去离子水清洗磁珠微球，得到磷脂双分子层磁珠；

4、步骤二、磁珠悬浮液制备：将温吞20、聚乙二醇加入到生理盐水中，以100-200r/min搅拌1-3min，加入磷脂双分子层磁珠以20-40r/min震荡混匀10-20s，得到磁珠悬浮液；

5、步骤三、样品裂解孵育：取样品加入到1.5ml的离心试管中，向上述离心试管中加入磁珠混悬液、细胞裂解液以20-40r/min震荡混匀10-20s，在24-26℃并在紫光灯照射下孵育4-6min；

6、步骤四、磁吸吸附：将上述离心管置于磁力架中，静置1-2min，使磁珠完全被吸附到磁力架上，使用移液枪吸取并弃去上清液；

7、步骤五、磁珠洗涤除杂：向上述离心管中加入洗涤液，20-40r/min震荡混匀20-30s，静置15-25s，使磁珠完全被吸附到磁力架上，使用移液枪吸取并弃去上清液，得到磁珠-核酸复合物，完成核酸提取。

8、进一步的，步骤一中的磁性微球是羟基磁性微球、羧基磁性微球、环氧基磁性微球、四氧化三铁磁性微球其中的一种，且磁性微球粒径为500-1000nm。

9、进一步的，步骤一中磁性微球、磷脂酰肌醇、甲醇、3-(n-吗啉基)丙磺酸、氯化钠质量体积比g/ml为(6-10):(3-5):(5-7):(1-3):(1-3)。

10、进一步的，步骤二中温吞20、聚乙二醇、生理盐水体积比为(0.1-0.3):(1.5-2.5):(90-100)，且磷脂双分子层磁珠在溶液中浓度为10-30mg/ml。

11、进一步的，步骤三中样品加入量为100-200μl、磁珠混悬液加入量为15-25μl、细胞裂解液加入量为100-200μl。

12、进一步的，细胞裂解液由质量体积比g/ml为(3-5):(0.5-1.0):(1-2):(0.4-0.6):(1-3)的奎宁、蛋白酶k、十二烷基硫酸钠、4,4'-二羟基偶氮苯、氨丁三醇组成。

13、进一步的，紫光灯照射时波长设置为300-400nm、光照强度设置为800-1200lux。

14、进一步的，洗涤液加入量为400-600μl。

15、进一步的，洗涤液由质量体积比g/ml为(5-10):(5-10):(70-80)的椰油酰胺丙基甜菜碱、尿素、乙醇组成。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过对磁珠进行表面修饰，制得磷脂双分子层磁珠，磷脂双分子层具有独特的生物相容性和仿生特性。当磁珠表面修饰了磷脂双分子层，这种仿生界面能够降低核酸与磁珠之间的界面张力，使得核酸更容易与磁珠表面接触并结合。且磷脂分子通常包含带负电荷的磷酸基团和疏水的脂肪酸链。当磷脂双分子层覆盖在磁珠表面时，这些负电荷可以与核酸分子上的正电荷区域发生静电相互作用，有助于将核酸分子拉近磁珠表面，并促进其结合。本发明在样品裂解孵育时采用特定成分的裂解液并结合紫光灯照射不仅提高了裂解效率，还进一步提高了裂解程度，所提取出的核酸浓度、纯度更高。通过对磁珠表面修饰、采用特定裂解液裂解孵育，使得本发明的磁珠与核酸特异性结合程度高，只经一次洗涤，免去了洗脱步骤，制得的得到磁珠-核酸复合物可直接作为后续核酸检测靶标，减少了多次洗涤和洗脱过程中造成的核酸损失和稀释，提高了核酸的浓度和纯度。

技术特征：

1.一种基于磁珠法的核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种基于磁珠法的核酸提取方法，其特征在于，所述步骤一中所述的磁性微球是羟基磁性微球、羧基磁性微球、环氧基磁性微球、四氧化三铁磁性微球其中的一种，所述磁性微球粒径为500-1000nm。

3.如权利要求1所述的一种基于磁珠法的核酸提取方法，其特征在于，所述步骤一中所述磁性微球、磷脂酰肌醇、甲醇、3-(n-吗啉基)丙磺酸、氯化钠质量体积比g/ml为(6-10):(3-5):(5-7):(1-3):(1-3)。

4.如权利要求1所述的一种基于磁珠法的核酸提取方法，其特征在于，所述步骤二中所述温吞20、聚乙二醇、生理盐水体积比为(0.1-0.3):(1.5-2.5):(90-100)，所述磷脂双分子层磁珠在溶液中浓度为10-30mg/ml。

5.如权利要求1所述的一种基于磁珠法的核酸提取方法，其特征在于，所述步骤三中样品加入量为100-200μl、磁珠混悬液加入量为15-25μl、细胞裂解液加入量为100-200μl。

6.如权利要求5所述的一种基于磁珠法的核酸提取方法，其特征在于，所述的细胞裂解液由质量体积比g/ml为(3-5):(0.5-1.0):(1-2):(0.4-0.6):(1-3)的奎宁、蛋白酶k、十二烷基硫酸钠、4,4'-二羟基偶氮苯、氨丁三醇组成。

7.如权利要求5所述的一种基于磁珠法的核酸提取方法，其特征在于，所述紫光灯照射时波长设置为300-400nm、光照强度设置为800-1200lux。

8.如权利要求1所述的一种基于磁珠法的核酸提取方法，其特征在于，所述步骤五中所述洗涤液加入量为400-600μl。

9.如权利要求8所述的一种基于磁珠法的核酸提取方法，其特征在于，所述洗涤液由质量体积比g/ml为(5-10):(5-10):(70-80)的椰油酰胺丙基甜菜碱、尿素、乙醇组成。

技术总结本发明提供了一种基于磁珠法的核酸提取方法，包括以下步骤：步骤一、磁珠表面修饰；步骤二、磁珠悬浮液制备；步骤三、样品裂解孵育；步骤四、磁吸吸附；步骤五、磁珠洗涤除杂。本发明通过对磁珠进行表面修饰，制得磷脂双分子层磁珠，能够降低核酸与磁珠之间的界面张力，使得核酸更容易与磁珠表面接触并结合。本发明在样品裂解孵育时采用特定成分的裂解液并结合紫光灯照射。通过对磁珠表面修饰、采用特定裂解液裂解孵育，使得本发明的磁珠与核酸特异性结合程度高，只经一次洗涤，免去了洗脱步骤，制得的得到磁珠‑核酸复合物可直接作为后续核酸检测靶标，减少了多次洗涤和洗脱过程中造成的核酸损失和稀释，提高了核酸的浓度和纯度。技术研发人员：柯焕春,严广华受保护的技术使用者：信天翁生物科技（广州）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/26