含有脐带间充质干细胞的产品、其培养筛选方法以及应用与流程

本技术涉及生物制药，具体涉及含有脐带间充质干细胞的产品、其培养筛选方法以及应用。

背景技术：

1、间充质干细胞(mscs)是多能干细胞。间充质干细胞除了具有自我更新能力和多向分化能力外，还具有免疫调节、抗炎和抗t、b、nk细胞及巨噬细胞等免疫细胞增殖的功能。这些独特的免疫调节特性使间充质干细胞成为治疗自身免疫性疾病的热点，如移植物抗宿主病、克罗恩病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮和系统性硬化症等，都显示出良好的临床应用前景。

2、间充质干细胞对先天和适应性免疫系统的调节作用主要依赖于间充质干细胞的旁分泌能力，这可以通过分泌高水平的可溶性因子来实现。因此，间充质干细胞的免疫调节作用非常依赖于这些细胞在给药后成功迁移到所需组织。不幸的是，间充质干细胞的归巢是低效的，只有一小部分细胞在系统管理后到达目标组织。大多数间充质干细胞在外周静脉移植后被发现被困在肺部。这可以归因于毛细血管系统的机械阻抗。这种损耗是实现基于间充质干细胞疗法的全部治疗潜力的一个主要瓶颈。

3、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，sle)是一种严重影响人类健康的自身免疫疾病，会导致患者免疫失调、多器官衰竭，有30％的难治性患者无药可治，两年死亡率高达35％。目前全世界大约有420万患者，其中中国目前约有120万患者，且近年发病率逐年上升。狼疮性肾炎(lupusnephritis，ln)是其中最常见的并发症之一，40％～60％的sle患者起病初即有ln，目前临床常规性疗法呈现疗效不佳、毒副作用大导致患者难以耐受的困境。与没有累及肾脏的患者相比，ln患者预后更差。在我国sle患者中，肾脏受累是仅次于感染的第二位死亡原因。ln也是我国最常见的继发性肾小球疾病和导致终末期肾病(esrd)的重要原因之一。约20％的患者在明确诊断10年后进展为esrd，为公共卫生带来了巨大负担。除sle全身表现外，临床主要表现为血尿、蛋白尿、肾功能不全等。尿蛋白/肌酐算是判断肾脏功能的金指标，尿蛋白/肌酐越高，表明肾脏功能越差。

4、系统性硬化症(systemicsclerosis，ssc)又称硬皮病，是一种以皮肤、血管和内脏器官(包括心、肺、肾和胃肠道等)纤维化为特征的结缔组织病。临床上分为两个主要亚型：局限皮肤型ssc(cutaneous limited ssc，lcssc)与弥漫皮肤型ssc(cutaneous diffusessc，dcssc)。局限皮肤型ssc皮肤纤维化局限于手指、手和面部。弥漫皮肤型ssc皮肤弥漫性硬化，通常始于手指和手，渐延及前臂、上肢、面部、躯干及下肢。ssc严重程度和发展情况异质性较大，常伴随多种器官严重受累，后期5年的致死率高达50％以上。

5、ssc发病率为1～2/10万，患病率仅次于类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)、系统性红斑狼疮，位居结缔组织疾病的第3位。临床上主要为30～50岁的患者，女性是男性的3～4倍。尽管ssc发病和致死率很高，但目前尚未建立有效的治疗方法，现有的药物治疗在逆转和阻止疾病进展方面基本无效。临床通常只能对患者进行对症治疗，以减轻疼痛或改善器官功能。在起病3-5年关键期内，现有药物无法阻止疾病进展至重要脏器，而且可能诱发各种累及脏器的不良反应，成为导致患者死亡的主要原因之一。因此，纾解ssc患者的用药困境，确保生命安全已经迫在眉睫。

6、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)作为能够自我更新、增殖、多向分化且能够发挥免疫调控作用的一类细胞，具有突出的免疫调控能力和良好的安全性，在体外和体内均表现出免疫调节、免疫抑制、促血管生成、抗炎、抗纤维化等特性，mscs已在多种自身免疫性疾病的治疗实践中显示出安全有效。mscs已被应用于多种自身免疫性疾病的治疗，如治疗sle、ra、干燥综合征(sjogren syndrome，ss)及炎症性肠病(inflammatorybowel disease，ibd)，且未见不良反应的报道。

技术实现思路

1、针对上述存在的技术局限性，本技术提出了含有脐带间充质干细胞的产品、其培养筛选方法以及应用；其克服了背景技术中提到的不足和缺陷。

2、为实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：

3、本技术的第一个发明点是提供了一种用于治疗免疫性疾病及免疫性相关疾病的生物制品，所述生物制品包括：细胞表面含有标志物的脐带间充质干细胞，所述标志物包括slc3a2和/或clic4，且优选任意一种标志物的表达量均不小于90％。

4、可选地，上述的生物制品，所述免疫性疾病为自体免疫性疾病；优选为红斑狼疮和/或结缔组织疾病；所述免疫性相关疾病为狼疮相关疾病和/或结缔组织相关疾病；优选为狼疮肾炎和/或系统性硬化症。

5、本技术的第二个发明点是提供了一种用于治疗免疫性疾病及免疫性相关疾病的生物制品，所述生物制品为含有细胞表面标志物和细胞因子受体的脐带间充质干细胞，所述细胞表面标志物包括slc3a2和/或clic4，所述细胞因子受体包括cxcr3和/或il4i1；

6、且优选地，以上任意一种表面标志物的表达量均不小于90％；任意一种细胞因子受体的含量均不小于40％。

7、可选地，上述的生物制品，所述免疫性疾病为自体免疫性疾病；优选为红斑狼疮和/或结缔组织疾病；所述免疫性相关疾病为狼疮相关疾病和/或结缔组织相关疾病；优选为狼疮肾炎和/或系统性硬化症。

8、本技术的第三个发明点是提供了一种上述的生物制品的培养及筛选方法，脐带间充质干细胞培养过程中，当汇合度达到50-90％时进行换液培养，培养12-30小时后进行收获，再以表面标志物slc3a2和/或clic4的表达量不小于90％为标准进行筛选。

9、可选地，上述的生物制品的培养及筛选方法，所述换液培养过程中所换的培养液，为加入质量体积比1％-5％血清替代物的dmem培养液；所述血清替代物优选为人血小板裂解物hpl。

10、本技术的第四个发明点是提供了一种上述的生物制品的培养及筛选方法，脐带间充质干细胞培养过程中，当汇合度达到50-90％时进行换液培养，培养12-30小时后进行收获，再以表面标志物slc3a2和/或clic4的表达量不小于90％、以及细胞因子受体cxcr3和/或il4i1的含量不小于40％为标准进行筛选。

11、可选地，上述的生物制品的培养及筛选方法，所述换液培养过程中所换的培养液，为加入质量体积比1％-5％血清替代物的dmem培养液；所述血清替代物优选为人血小板裂解物hpl。

12、本技术的第五个发明点是提供了上述的生物制品或通过尚述的方法获得的所述生物制品在制备用于治疗免疫性疾病及免疫性相关疾病的产品中的应用，所述脐带间充质干细胞为培养后筛选得到的细胞表面标志物表达量不小于90％的脐带间充质干细胞，所述表面标志物包括slc3a2和/或clic4。

13、本技术的第六个发明点是提供了上述的生物制品或通过尚述的方法获得的所述生物制品在制备用于治疗免疫性疾病及免疫性相关疾病的产品中的应用，所述脐带间充质干细胞为培养后筛选得到的细胞表面标志物表达量不小于90％的、以及细胞因子受体的含量不小于40％的脐带间充质干细胞；所述表面标志物包括slc3a2和/或clic4，所述细胞因子受体为cxcr3和/或il4i1。

14、与现有技术相对比，本技术具有以下优点：

15、本技术提供了含有脐带间充质干细胞的产品、其培养筛选方法以及应用，具体地：

16、本技术中，生物制品为含有特定种类和表达量的细胞因子的脐带间充质干细胞，或者为含有特定种类和表达量的细胞因子以及含有特定种类和表达量的细胞因子受体，该生物制品对免疫性疾病及免疫性相关疾病具有极佳的治疗作用，尤其是其对狼疮肾炎和硬皮病等的治疗作用效果极其明显的高于含有其他类型脐带间充质干细胞的生物制品。基于以上技术优势，本技术的生物制品具有极大的市场应用和推广前景。

17、本技术是针对狼疮肾炎和/或系统性硬化症的治疗药物应用。为保证自身免疫疾病相关细胞因子的高效表达，本技术进行了巧妙的换液制备工艺。本技术结合单细胞测序qpcr及流式等多种手段，筛选出对于狼疮性肾炎和/或系统性硬化症有作用的脐带间充质干细胞，此类脐带间充质干细胞分泌治疗狼疮性肾炎和/或系统性硬化症的相关细胞因子，为狼疮性肾炎和/或系统性硬化症的临床研究提供理论依据，同时通过细胞因子cxcl10和细胞因子受体cxcr3的关联性研究，确定了用于治疗狼疮性肾炎和/或系统性硬化症的脐带间充质干细胞制备方向。