一种复合型可注射水凝胶及其制备和应用方法

本发明涉及化学工程和生物医药领域，具体涉及一种复合型可注射水凝胶及其制备和应用方法。

背景技术：

1、水凝胶（hydrogel）是以水为分散介质的高分子网络体系，可以吸收大量水分，并保持一定的形状。水凝胶性质柔软，弹性模量接近人体的软组织器官，在药物转运、生物医学领域有着重要的应用价值。原位可注射水凝胶是近年来出现的一种新型水凝胶体系，利用水凝胶体系的流动性，通过注射的方法将高分子材料植入体内，手术创伤非常微小，还容易满足布满不规则创伤面对材料的要求，在组织器官缺损修复中发挥出越来越大的作用。

2、聚n-异丙基丙烯酰胺（p(nipam)）水凝胶具有温敏性特性，当温度低于其较低临界溶解温度（lcst）32℃时，在水中形成良好的水化状态，当温度达到32℃时呈收缩状态。但现有的p(nipam)水凝胶，普遍存在透明性差、弹性差、温度响应性差、机械强度低、适用面窄等特点，限制了其在生物医学领域的应用。

3、本发明开发一种复合型可注射水凝胶，以n异丙基丙烯酰胺（nipam)）单体为基本原料，通过在聚合反应中引入巯基（-sh）和不饱和烯键（c=c），形成预聚物一p(nipam-cys)和预聚物二p(nipam-cys-vinyl)。p(nipam-cys)与p(nipam-cys-vinyl)溶液在常温下与生物活性物质（如细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、药物）复合，32℃～37℃环境下通过硫醇-烯键共价反应，快速形成温敏型高强度可注射水凝胶。这种温敏型高强度可注射水凝胶在生物材料、药物控释、生化分离、化学传感器等方面具有非常广阔的应用前景，尤其在一些组织器官，如软骨、骨、脊柱、牙、韧带、神经、血管、肝脏、心脏、肾脏、胰脏、肺脏，的制造与修复，及伤口止血、糖尿病足愈合、防手术粘连、动脉瘤栓塞，等制剂的制造与应用中具有非常突出的优势和效果。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种复合型可注射水凝胶及其制备和应用方法。本发明制备的复合型可注射水凝胶成胶速度快、机械强度高、生物活性物质与药物承载量大、生物相容性好、结构稳定、使用范围广，可用作止血材料、伤口敷料、动脉瘤栓塞剂、靶向生物活性物质（如细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、药物）递送载体（如纳米载药系统）和组织器官制造与修复材料。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。

3、本发明公开了一种复合型可注射水凝胶，其特征在于，所述水凝胶前体主要由预聚物一p(nipam-cys)溶液、预聚物二p(nipam-cys-vinyl)溶液、生物活性物质（如细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、生物活性小分子）和/或药物组成。

4、进一步地，所述预聚物一p(nipam-cys)以异丙基丙烯酰胺(nipam)单体为基本原料，通过在聚合反应单体nipam中引入定量的n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（nas），增加聚合反应中活性基团巯基（-sh）的含量形成。

5、进一步地，所述预聚物二p(nipam-cys-vinyl)以预聚物一p(nipam-cys)为基本原料，在预聚物一p(nipam-cys)分子中引入二乙烯砜（divinylsulfone），增加聚合反应中不饱和键的含量形成。

6、进一步地，所述复合型可注射水凝胶还包括生物活性物质（如细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、生物活性小分子）和/或药学上可接受的药物。

7、本发明还公开了一种上述任一项所述的复合型可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括一下步骤：

8、第一步预聚物一p(nipam-cys)合成：

9、（1）称取市场上采购的异丙基丙烯酰胺(nipam)粉末25g置于500ml三颈瓶中，加入250ml无水四氢呋喃（thf），nipam溶解后加入定量的n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（nas）并搅拌使之溶解，用氮气（n2）泡除去反应体系中的氧气（o2），再加入引发剂偶氮二异丁腈（aibn），将反应体系加热到65℃，在n2环境下反应24h，得粗放的反应产物p(nipam-nas)；将反应产物用乙醚沉淀，滤纸过滤，制得精制的p(nipam-nas)；

10、（2）将市场上采购的氯化氢巯基乙胺（cys·hcl）按质量百分比2%溶于无水二氯甲烷（dcm），加入三乙胺（n(et)3），搅拌过液，形成透明溶液；将步骤（1）制得的精制的p(nipam-nas)以质量百分比5%溶于无水thf，加入上述透明溶液中，室温n2环境下反应过夜，再加入二硫代苏糖醇（dtt）和cys·hcl，缩合反应2h，将其中dcm蒸发掉后用乙醚沉淀产物，滤纸过滤、蒸馏水透析、真空干燥后得粉末状预聚物一p(nipam-cys)；

11、第二步预聚物二p(nipam-cys-viny)合成：

12、称取10g由步骤一制得的p(nipam-cys)置于500ml三颈瓶中，其中加入100ml无水dcm，使之溶解，加入2ml无水thf和二乙烯砜（divinylsulfone），室温下反应16h，得反应产物p(nipam-cys-vinyl)；将其中dcm蒸发掉后用乙醚沉淀反应产物、滤纸过滤、蒸馏水透析、真空干燥后得粉末状预聚物二p(nipam-cys-vinyl)；

13、第三步复合型可注射p(nipam-cys-vinyl-cys)水凝胶的制备：

14、将前两步合成的预聚物一p(nipam-cys)和预聚物二p(nipam-cys-vinyl)分别溶于pbs溶液、dmem细胞培养液或水中，在室温下以混合均匀，加入生物活性物质（如细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、生物活性小分子）和/或药物，将体系温度升高到32℃～37℃，两种预聚物自发聚合在一起，形成含生物活性物质的复合型可注射p(nipam-cys-vinyl-cys)水凝胶。

15、进一步地，第一步（1）中所述nas与nipam单体的摩尔比范围为1%～100%；aibn与nipam单体的质量百分比范围为0.1%～1%；（2）中所述n(et)3与dcm质量百分比范围为1%～10%；dtt与dcm质量百分比范围为1%～10%。

16、进一步地，第二步中所述二乙烯砜（divinylsulfone）的用量范围为预聚物一p(nipam-cys)摩尔浓度的1%～100%。

17、进一步地，第三步中预聚物一p(nipam-cys)和预聚物二p(nipam-cys-vinyl)溶液以质量百分比9:1～1:9混合均匀。

18、进一步地，所述制备方法还包括以下步骤：

19、（1）活细胞悬液制备：将培养瓶中融合度达80%以上的细胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02%edta消化、离心，制得离心沉淀物，将离心沉淀物悬浮于0.5mlpbs溶液或dmem细胞培养液中，制得活细胞悬浮液；

20、（2）活细胞、活性分子、药物微球制备：将海藻酸钠粉末溶于pbs溶液，制成质量百分比为1%～5%的海藻酸钠溶液；将细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、生物活性小分子、药物分别或两个以上复合后加入0.5mlpbs溶液或dmem细胞培养液中，再以质量百分比为0.1%～10%加入海藻酸钠溶液中，搅拌均匀，制得含细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、生物活性小分子、药物的海藻酸钠混合物，利用注射器将含细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、生物活性小分子、药物的海藻酸钠混合物注入京尼平pbs溶液（京尼平浓度为10～100mg/ml）或氯化钙pbs溶液中（氯化钙浓度1%～10%w/v），过滤、收集含细胞、活性分子、药物的海藻酸钠纳米微球；

21、（3）活细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、生物活性小分子、药物与p(nipam-cys-viny-cys)高分子网络复合：将步骤（1）、（2）制得的活细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、生物活性小分子及药物悬浮液或纳米颗粒中的一种或两种以上复合物，以质量百分比0.01%～20%加入到预聚物一p(nipam-cys)和聚物二p(nipam-cys-vinyl)的pbs溶液或dmem细胞培养液中，室温下搅拌均匀，将体系温度升高到32℃～37℃，制得含活细胞、细胞外泌体、脱细胞基质材料、生长因子、生物活性小分子及药物的复合型可注射水凝胶。

22、与现有技术比，本发明的有益效果如下。

23、本发明以异丙基丙烯酰胺(nipam)单体为基本原料，通过在聚合反应单体nipam中引入定量的n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（nas），增加聚合反应中活性基团巯基（-sh）的含量，形成预聚物一，p(nipam-cys)。在预聚物一p(nipam-cys)分子中引入二乙烯砜（vinylsulfone），增加聚合反应中不饱和键（即烯键，vinyl）的含量，形成预聚物二，p(nipam-cys-vinyl)。将预聚物一和预聚物二溶液按比例混合，加入生物活性物质，如活细胞、活性分子和药物中的至少一种，32℃～37℃下形成复合型可注射p(nipam-cys-vinyl-cys)水凝胶。本发明制备的复合型可注射水凝胶成胶速度快、机械强度高、生物活性物质与药物承载量大、生物相容性好、结构稳定、使用范围广，可用作止血材料、伤口敷料、动脉瘤栓塞剂、靶向生物活性物质与药物递送载体（如纳米载细胞与药物系统）和组织器官制造与修复材料。