一种直接诱导芽再生的方法及其应用

本发明涉及植物基因工程，具体涉及一种直接诱导芽再生的方法及其应用。

背景技术：

1、再生是已经分化的组织或细胞重新形成新组织的过程(birnbaum and sánchezalvarado，2008；ikeuchi et al.,2016；kareem et al.,2016；sugimoto et al.,2011；sugimoto et al.,2019)。高等植物可以通过组织修复、器官从头再生或者体细胞胚胎发生三种方式进行再生，其中，器官从头再生是指从受伤或离体的植物组织上再生出不定根或者不定芽的过程，包括根从头再生和芽从头再生(shin et al.,2020)。

2、芽的再生是器官从头再生的主要方式之一，涉及了大量细胞命运的转变。研究发现，植物的芽再生可分为直接和间接两种类型。在间接芽再生过程中，外植体先在富含生长素的愈伤组织诱导培养基(callusinducing medium)上诱导愈伤组织形成，然后转到富含细胞分裂素的芽诱导培养基(shoot-inducing medium)上诱导芽再生。而在直接芽再生过程中，侧根原基(lateral root primordia)可以不经过愈伤组织的产生直接转分化为茎尖分生组织，此过程无愈伤组织产生。

3、对于直接芽再生和间接芽再生之间的调控机制，有研究以拟南芥幼苗的下胚轴和根作为外植体，依次在含有生长素和细胞分裂素的培养基中培养，使得经由愈伤组织间接芽再生和侧根原基直接芽再生两种体系在一个外植体上同时发生，利用报告株系的分析发现，wox5、wus、scr和arr1在两种芽再生过程之间表现出相似的表达模式。wox11在两种再生过程中存在差异，在芽的间接再生过程中，表达wox11的起始细胞数量较多，从而形成体积较大的茎尖分生组织；而在直接再生过程中，表达wox11的起始细胞数量较少，因而产生体积较小的茎尖分生组织。

4、wox(wuschel-related homeobox)转录因子与植物发育密切相关，包括植物胚胎发育和体胚发生、花和根发育、愈伤组织的形成和维持，以及干细胞维持等过程。拟南芥有15个wox成员，不同wox转录因子具有表达模式的组织特异性和功能的特异性，其中，与其他wox转录因子不同的是，wox2的同源异形结构域的下游还有1个假定的锌指结构域。而wox2与植物芽再生之间的关联性还未见有报道。

5、目前，芽再生过程主要通过愈伤组织阶段的间接芽再生来实现，整个过程培养时间较长，步骤较为繁琐，因此，发掘高效的芽再生系统对于农业推广应用非常重要。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种直接诱导芽再生的方法及其应用。本发明研究发现，过量表达wox2基因能够高效率的直接诱导芽再生，无需添加外源的植物激素，只需要在基本的培养基上培养，就能够在转基因植株的根上诱导形成芽，为植物的大规模无性繁殖提供了技术支持。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供wox2基因在诱导芽再生中的应用；所述wox2基因是如下i)或ii)或iii)所示的dna分子：

4、i)核苷酸序列是seq id no.1所示的dna分子；

5、ii)除i)以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的dna分子；

6、iii)与i)或ii)限定的dna片段具有90％或90％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seq id no.2所示的蛋白等价的dna分子。

7、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同源性可以用计算机软件进行评价，例如可采用blast算法测定(altschul et al.1990.journal of molecularbiology 215:403-410；karlin and altschul.1993.proceedings of the nationalacademy of sciences 90:5873-5877)。

8、上述核酸分子中，所述90％或90％以上同源性可以为至少90％、92％、93％、95％、96％、98％或99％的同源性。

9、上述应用中，所述芽再生为直接芽再生。

10、本发明的第二方面，提供wox2基因编码的蛋白在诱导芽再生中的应用。

11、上述应用中，所述wox2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

12、上述应用中，所述芽再生为直接芽再生。

13、本发明的第三方面，提供含有wox2基因的重组表达载体或基因工程菌在诱导芽再生中的应用。

14、上述应用中，所述芽再生为直接芽再生。

15、上述应用中，所述重组表达载体为含有wox2基因的per8载体。per8载体为雌激素诱导型表达载体，研究发现，与组成型表达载体相比，利用per8载体构建的转基因植株能够显著提高wox2基因的表达量。

16、本发明的第四方面，提供一种直接诱导芽再生的方法，包括以下步骤：

17、上调植物中wox2基因的表达，获得转基因植株；收集转基因植株的种子，对种子进行萌发处理，将种子萌发后的幼苗在不含生长素和细胞分裂素的培养基中培养12-16天，在幼苗的根部长出不定芽。

18、上述方法中，上调植物中wox2基因的表达是通过如下手段实现的：

19、外源转入wox2基因；或者导入能够激活或提高wox2基因的转录水平或翻译水平或蛋白活性的dna片段。

20、上述方法中，对种子进行萌发处理的方法包括：将消毒处理后的种子平铺于含有10μmol/ml雌激素的1/2ms萌发培养基上，4℃春化处理3天打破休眠，春化结束后将种子在22℃进行16h光照/8h黑暗培养。

21、上述方法中，所述不含生长素和细胞分裂素的培养基为含有10μmol/ml雌激素的1/2ms培养基。

22、本发明的第五方面，提供上述直接诱导芽再生的方法在如下(1)或(2)中的应用：

23、(1)构建芽再生的培养体系；

24、(2)规模化种苗生产。

25、本发明的有益效果：

26、本发明首次研究发现，wox2基因过量表达可以较高效率的直接诱导芽再生，无需添加外源的植物激素，只需要在基本的培养基上培养，就能够在转基因植株的根上诱导形成芽。该体系具有操作简单、培养程序简易、培养周期短、发生频率高等优势，由于芽再生体系较为稳定，可以在分子水平上研究其发生的分子机制。且对于与生产结合进行规模化种苗生产也具有指导意义。

技术特征：

1.wox2基因在诱导芽再生中的应用，其特征在于，所述wox2基因是如下i)或ii)或iii)所示的dna分子：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芽再生为直接芽再生。

3.wox2基因编码的蛋白在诱导芽再生中的应用，其特征在于，所述wox2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4.含有wox2基因的重组表达载体或基因工程菌在诱导芽再生中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体为含有wox2基因的per8载体。

6.一种直接诱导芽再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，上调植物中wox2基因的表达是通过如下手段实现的：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对种子进行萌发处理的方法包括：将消毒处理后的种子平铺于含有10μmol/ml雌激素的1/2ms萌发培养基上，4℃春化处理3天打破休眠，春化结束后将种子在22℃进行16h光照/8h黑暗培养。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述不含生长素和细胞分裂素的培养基为含有10μmol/ml雌激素的1/2ms培养基。

10.权利要求6-9任一项所述的方法在如下(1)或(2)中的应用：

技术总结本发明公开了一种直接诱导芽再生的方法及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明首次研究发现，WOX2基因过量表达可以较高效率的直接诱导芽再生，无需添加外源的植物激素，只需要在基本的培养基上培养，就能够在转基因植株的根上诱导形成芽。该体系具有操作简单、培养程序简易、培养周期短、发生频率高的优势，由于芽再生体系较为稳定，可以在分子水平上研究其发生的分子机制。且对于与生产结合进行规模化种苗生产也具有指导意义。技术研发人员：张文杰,苏英华,唐丽苹,于洋,翟立明受保护的技术使用者：山东农业大学技术研发日：技术公布日：2024/10/10