来源于鸡的生物标志物DNAJB11及其筛选方法和应用

本发明属于生物，涉及能够反应鸡热应激状态的生物标志物，具体为来源于鸡的生物标志物dnajb11及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、因肉鸡身覆羽毛且无汗腺，皮下及腹下脂肪多，造成其对高热环境耐受力十分低下。因此，热应激（heat stress，hs）便成为导致肉鸡生产力下降和死亡率升高的重要原因之一。热应激不仅使鸡的组织器官发育受到影响，免疫力、生产性能也显著下降，甚至还会造成大量鸡只的死亡。

2、心脏是动物机体生命存活最重要的保障器官之一。而鸡在热应激初期即可呈现出异乎寻常的高猝死现象。研究表明，热应激在体内外水平上均可诱导鸡心肌细胞发生以细胞肿胀、急性变性为特征的病理变化甚至是细胞凋亡、坏死，超微病理观察则表现为亚细胞结构线粒体的肿胀、嵴脱落，光镜下观察热应激鸡心肌组织则显示有心肌纤维的断裂。

3、当暴露于热应激环境时，鸡机体组织细胞会迅速合成一系列非特异性、保守性自我保护蛋白-热休克蛋白（heat shock proteins，hsps）。它们能在急性过程中快速有效地修复细胞损伤，进而维持细胞稳态、促进机体热耐受。dnajb11（dnaj heat shock proteinfamily (hsp40) member b11）是一种hsp40共伴侣蛋白，在众多生物体中保守表达，主要定位于内质网，常以四聚体形式在保障内质网蛋白质稳态中发挥核心作用。其功能涉及内质网所有分泌蛋白和膜蛋白的糖基化、折叠、组装、转运，控制失败蛋白的降解，mrna修饰以及atp依赖酶的活性调节等。

4、受热带岛屿气候影响，海南全年约2/3时间处于高温状态，鸡只更是普遍遭受热应激，其中，列入国家畜禽遗传资源保护名录、占海南全省肉鸡饲养出栏量71%的文昌鸡具有公认的优良抗热性状。通过从解析文昌鸡优良抗热性状形成的生物学基础出发，以期发现并确证调控鸡只抗热生存能力的关键分子，同时阐明其抵抗热应激损伤的分子机制，对于监测、预防、缓解鸡热应激损伤、研发有效制剂具有重大意义。

技术实现思路

1、解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，在畜禽养殖过程中，能够监测畜禽的热应激状态，且具有良好的特异性和灵敏度；另外，监测畜禽自身是否能够缓解热应激损伤或抗猝死能力；鉴于此，本发明提供了来源于鸡的生物标志物dnajb11及其筛选方法和应用。

2、技术方案：来源于鸡的生物标志物dnajb11，所述生物标志物为具有辅助伴侣功能的可溶性内质网糖蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示：

3、mapgwlgrvcllllclcgeaaagrdfykilgvsrgasvkdikkayrklalqlhpdrnpddpraqekfqdlgaayevlsdeekrkqydaygeeglkdghqsshgdifshffgdfgfmfggnprqqdrniprgsdiivdlevtleevysgnfvevvrnkpvarqapgkrkcncrqemrttqlgpgrfqmtqevvcdecpnvklvneertleveiepgvrdgmeypfigegephvdgepgdlrfrikvlkhpvferrgddlytnvtislvealtgfemdithldghkvhvardkitkpgaklwkkgeglpnfdnnnikgsliitfdvefpkeqltseqreglkqllkqgsvqkvynglqgy。

4、优选的，所述生物标志物合成、分泌自鸡心脏细胞，分泌水平随热应激时间的延长而逐渐升高。

5、优选的，所述生物标志物分布于内质网上。

6、以上任一所述来源于鸡的生物标志物dnajb11的筛选方法，所述方法包括以下步骤：

7、s1、将鸡分为对照组和热应激处理组，热应激处理条件为温度42±1℃、相对湿度65%、5h，处理后采集对照组(con)、热应激处理存活组(hss)、热应激处理死亡组(hsd)鸡的心脏组织；

8、s2、将s1采集的三组心脏组织样本分别混合后置于三个管中，进行无标记定量蛋白质组学检测，筛选差异表达蛋白；

9、s3、对s2中得到的组织进行蛋白质提取和消化，得到多肽，通过纳米液相色谱质谱法对多肽进行分离和质谱分析；

10、s4、将s3中扫描得到的原始ms文件使用蛋白质组发现者软件进行处理和分析，筛选显著上调蛋白和显著下调蛋白；其中，上调倍数最高的蛋白质即为生物标志物dnajb11。

11、以上任一所述来源于鸡的生物标志物dnajb11在制备畜禽热应激状态检测试剂盒中的应用。

12、优选的，所述应激状态包括：畜禽是否发生热应激、热应激损伤加重、具有热应激猝死风险。

13、优选的，所述试剂盒用于实时监测畜禽养殖过程中的热应激状态。

14、以上任一所述来源于鸡的生物标志物dnajb11在制备指示畜禽具有缓解热应激损伤或抵抗猝死能力的试剂盒中的应用。

15、以上任一所述来源于鸡的生物标志物dnajb11在畜禽抗逆生物育种中的应用。

16、以上任一所述来源于鸡的生物标志物dnajb11在制备畜禽抗热应激药物中的应用。

17、本发明所述生物标志物dnajb11作用的原理在于：经比较研究显示，在极端热应激下（42±1℃，相对湿度65%），文昌鸡的热应激（5h）终末死亡率为62.5%，而白羽肉鸡为100%且大多在热应激3h左右或更早死亡。而体内外研究表明，文昌鸡在热应激条件下的心脏损伤程度也显著轻于白羽肉鸡，我们对热应激文昌鸡心肌组织的病理学观察也显示，热应激存活组的损伤程度要明显低于热应激死亡组。提示文昌鸡的抗热性能主要体现在高热环境下的极强生存能力，心肌组织细胞抵抗热应激损伤的能力应该是文昌鸡抗热生存能力的重要标志。本发明在建立文昌鸡热应激模型的基础上，对con、hsd与hss三组文昌鸡的心肌组织进行了蛋白质组学分析。与con组相比，dnajb11在hsd组和hss组均显著上调，且为hss组上调倍速最高的蛋白质（图4d）。我们随后对dnajb11在热应激心肌组织中的表达进行了蛋白免疫印迹试验作为验证，发现dnajb11在hsd组和hss组也均显著上调，且hss组升高更明显（图5a）。对热应激原代文昌鸡心肌细胞的检测显示，dnajb11表达水平随着热应激时间的延长也显著升高（图5b），而白羽肉鸡hs组的dnajb11的表达与con组相比，没有显著差异（图5c）。综合上述结果看，dnajb11与文昌鸡的抗热生存最具直接相关性，且极可能在心肌细胞抗热应激损伤过程中发挥重要积极作用。因此，我们选择dnajb11作为指示鸡抗热应激损伤能力的候选生物标志物。

18、有益效果：（1）本发明所述生物标志物能够判断鸡是否处于热应激状态、热应激水平、是否具有热应激猝死风险；（2）所述标志物能够指示畜禽是否具有缓解热应激损伤或抵抗猝死的能力；（3）所述标志物具有良好的特异性和灵敏度；（4）所述生物标志物在应激检测试剂盒开发、抗逆生物育种和抗应激药物研发中具有重要作用。