来源于大菱鲆肠道的铁达尼盐单胞菌HT-Tc3在大菱鲆养殖中的应用的制作方法

本发明涉及一株细菌的应用，具体涉及来源于大菱鲆肠道的铁达尼盐单胞菌ht-tc3在大菱鲆养殖中的应用，属于微生物。

背景技术：

1、大菱鲆(scophthalmus maximus)又名多宝鱼，具有生长速度快、耐低温、饲料转化率高、肉质鲜美等优点，是重要的海水养殖鱼类。养殖规模的迅速发展伴随产生大菱鲆病害问题，减少抗生素类渔药使用、寻求绿色健康防病手段尤为重要。

2、生物防病具有绿色无污染的特点，在畜牧、种植等领域病害防治中得到广泛应用。益生菌即有益微生物，作为生物防病的首选，已成为水产养殖业中改善养殖生物健康状况的有效策略之一。益生菌的使用在减少病原菌侵害、提高消化性能、增强机体抗逆性能以及改善养殖水体环境等方面发挥了积极作用，可实现病害源头防控。

3、现有对水产养殖益生菌的研究主要集中于外源性或非鱼类本身来源的益生菌或益生元，与内源性益生菌相比，无法有效地在鱼类肠道定植或主导肠道菌群，从而不能充分发挥益生作用。盐单胞菌属应用于生态改良研究较多，但在水产养殖中的应用研究较少。铁达尼盐单胞菌广泛分布于废水、污泥和油田等有机污染严重的区域，表明其可能具有降解水产养殖环境中有机污染物的能力。筛选分离鱼源铁达尼盐单胞菌作为水产养殖益生菌具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：提供一株来源于大菱鲆肠道并且对养殖大菱鲆具有促进生长发育、提高消化能力、改善肠道菌群结构以及增强抗病力作用的有益微生物——铁达尼盐单胞菌ht-tc3在大菱鲆养殖中的应用。

2、为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

3、来源于大菱鲆肠道的铁达尼盐单胞菌ht-tc3在大菱鲆养殖中的应用，将保藏编号为cctcc no：m20231666的铁达尼盐单胞菌ht-tc3制成冻干菌粉，并按照5wt‰的比例将制得的铁达尼盐单胞菌ht-tc3冻干菌粉添加到配合饲料中，然后对处于仔鱼期的大菱鲆进行投喂，配合饲料的每日投喂量为大菱鲆体重的5％，分两次投喂，早晚各投喂一次，至少投喂60天。

4、其中，将保藏编号为cctcc no：m20231666的铁达尼盐单胞菌ht-tc3制成冻干菌粉的方法具体如下：

5、(1)活化菌株：将保藏编号为cctcc no：m20231666的铁达尼盐单胞菌ht-tc3接种于mrs液体培养基中，28℃震荡培养24h；

6、(2)收集菌体并制成菌悬液：将活化好的菌液置于4℃离心机中离心，弃上清，沉淀用无菌pbs缓冲液洗涤，收集菌体并制成浓度为1.0×1010cfu/ml的菌悬液；

7、(3)添加冻干保护剂：将冻干保护剂与菌悬液混合均匀，得到添加有冻干保护剂的菌悬液；

8、(4)预冻：将添加有冻干保护剂的菌悬液置于冷冻机内-80℃预冻4h，得到预冻后的菌体；

9、(5)冻干：将预冻后的菌体放入真空冷冻干燥机内冻干24h，得到铁达尼盐单胞菌ht-tc3冻干菌粉。

10、优选的，在步骤(3)中，所用的冻干保护剂由脱脂乳粉、海藻糖、谷氨酸钠和甘油以质量比3：2：1：1组成；冻干保护剂与菌悬液按照35g：100ml的比例混合。

11、本发明的有益之处在于：

12、(1)铁达尼盐单胞菌ht-tc3从健康的养殖大菱鲆肠道中筛选获得，经实验证实，该菌株为革兰氏阴性杆菌，对健康大菱鲆无致病性；

13、(2)将铁达尼盐单胞菌ht-tc3制成冻干菌粉后，经拌饲投喂实验证实，外源补充铁达尼盐单胞菌ht-tc3提高了养殖大菱鲆的生长性能、免疫能力和消化能力，该菌株对大菱鲆肠道产生了积极影响(增加了肠绒毛高度、肠绒毛宽度和肌层厚度)，同时还增加了大菱鲆肠道几种潜在有益菌的相对丰度及肠道微生物多样性水平；

14、(3)经攻毒实验证实，外源补充铁达尼盐单胞菌ht-tc3可以延缓大菱鲆因感染杀鲑气单胞菌bhas-1而导致的发病死亡，有效降低养殖大菱鲆死亡率，增强养殖大菱鲆的抗病力，证明铁达尼盐单胞菌ht-tc3具有良好的定植性能，能够在养殖大菱鲆体内持续发挥益生作用。

技术特征：

1.来源于大菱鲆肠道的铁达尼盐单胞菌ht-tc3在大菱鲆养殖中的应用，其特征在于，将保藏编号为cctcc no：m20231666的铁达尼盐单胞菌ht-tc3制成冻干菌粉，并按照5wt‰的比例将制得的铁达尼盐单胞菌ht-tc3冻干菌粉添加到配合饲料中，然后对处于仔鱼期的大菱鲆进行投喂，配合饲料的每日投喂量为大菱鲆体重的5％，分两次投喂，早晚各投喂一次，至少投喂60天。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将保藏编号为cctcc no：m20231666的铁达尼盐单胞菌ht-tc3制成冻干菌粉的方法具体如下：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤(3)中，所用的冻干保护剂由脱脂乳粉、海藻糖、谷氨酸钠和甘油以质量比3：2：1：1组成。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤(3)中，冻干保护剂与菌悬液按照35g：100ml的比例混合。

技术总结本发明公开了来源于大菱鲆肠道的铁达尼盐单胞菌HT‑Tc3在大菱鲆养殖中的应用，属于微生物技术领域。其中，铁达尼盐单胞菌HT‑Tc3(保藏编号为CCTCC NO：M20231666)制成冻干菌粉后，经拌饲投喂实验证实，外源补充铁达尼盐单胞菌HT‑Tc3提高了养殖大菱鲆的生长性能、免疫能力和消化能力，该菌株对大菱鲆肠道产生积极影响，增加了肠道几种潜在有益菌的相对丰度及肠道微生物多样性水平，经攻毒实验证实，外源补充铁达尼盐单胞菌HT‑Tc3可以延缓大菱鲆因感染杀鲑气单胞菌BHAS‑1而导致的发病死亡，增强养殖大菱鲆的抗病力。技术研发人员：王鹤,许瀚之,赵晓伟,黄华,张丽文,赵延宁,王涵,李五受保护的技术使用者：烟台市海洋经济研究院（烟台市渔业技术推广站、烟台市海洋捕捞增殖管理站）技术研发日：技术公布日：2024/9/12