一种温郁金来源的香叶基香叶基焦磷酸合酶及编码基因和应用

本发明涉及药用植物基因工程，具体涉及一种温郁金来源的香叶基香叶基焦磷酸合酶及其编码基因和应用。

背景技术：

1、温郁金(curcuma wenyujin y.h.chen et c.ling)，姜科姜黄属植物，多年生草本。温郁金“一株三用”，主根茎蒸或煮熟后干燥即为“莪术”，主根茎趁鲜纵切厚片、晒干则为“片姜黄”，块根蒸或煮熟后干燥即为“郁金”，均被《中华人民共和国药典》收录。据唐《药性论》及李时珍的《本草纲目》记载：莪术具有行气破血，消积止痛之功效，被称为血中之气药。温郁金富含挥发油，现代药理研究表明具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等药理作用，萜类化合物为其主要成分(温郁金的化学成分和药理作用研究进展.现代药物与临床,2021,36(1):204-208)。

2、萜类化合物(terpenoids)是植物次生代谢产物中最大的一个家族，在自然界中广泛分布，由异戊二烯(isoprene，c5)单元组成的化合物及其衍生物，按碳原子的数目可以分为单萜(c10)、倍半萜(c15)、二萜(c20)、三萜(c30)和多萜等。

3、植物萜类化合物生物合成分两个阶段：1、定位在细胞质中的甲羟戊酸(mevalonate pathway，mva)途径和定位在质体中的甲基赤藓醇4-磷酸途径(methylerythritol 4-phosphate pathway，mep)生成异戊烯基焦磷酸(isopentenylpyrophosphate，ipp)，ipp在异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphateisomerase，idi)的作用下部分转化为双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallylpyrophosphate，dmapp)，这两种物质是所有萜类化合物的前体物质。2、香叶基香叶基焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase，ggpps)催化1分子dmapp和3分子ipp，或者1分子法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，fpp)和1分子ipp，生成具有c20骨架的香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate，ggpp)。ggpp是二萜、四萜包括类胡萝卜素、维生素e、叶绿素、赤霉素以及虾青素等化合物的共同前体，对植物生长发育、适应环境至关重要。

4、植物次生代谢产物为生命非必须物质，含量通常较低，利用合成生物学和代谢工程，在大肠杆菌等微生物宿主中进行异源生物合成，是大量获得次生代谢产物的有效途径。因此，深入研究温郁金中萜类化合物生物合成途径，从中克隆关键酶基因，采用合成生物学策略合成萜类化合物，有望成为温郁金源萜类生产的有效技术手段。

5、目前，尚未见到温郁金香叶基香叶基焦磷酸合酶的相关报导。编码温郁金香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因未被鉴定和克隆。

技术实现思路

1、本发明的目的在于通过研究温郁金中参与萜类物质合成途径的关键酶基因，提供一种参与香叶基香叶基焦磷酸合成的香叶基香叶基焦磷酸合酶基因及其编码的蛋白质，进而利用合成生物学策略通过微生物细胞工厂生产温郁金萜类物质。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明通过对温郁金的转录组进行测序分析和功能研究，从中筛得可以编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因cwggpps，所述基因的编码序列如seq id no.1所示，该基因编码的蛋白质具有催化法尼基焦磷酸和异戊烯基焦磷酸合成香叶基香叶基焦磷酸的生物活性。因此，本发明提供了一种温郁金来源的香叶基香叶基焦磷酸合酶基因，其开放阅读框长度为1041bp。

4、本发明提供了基因cwggpps编码的产物，该产物可以为rna、多肽或蛋白质。基因cwggpps编码的香叶基香叶基焦磷酸合酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、本发明中可以根据上述公开的基因序列以及编码产物序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，得到编码产物的突变序列，该突变序列也属于本发明的保护范围。

6、基于上述公开的基因序列构建相应的重组质粒、基因工程菌，进而用于香叶基香叶基焦磷酸合酶的异源合成以及催化生产香叶基香叶基焦磷酸。

7、本发明提供了包含基因cwggpps的重组质粒，重组质粒包括原始载体以及插入于载体多克隆位点的目的基因片段，所述目的基因片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。

8、本发明中可以根据使用目的选择合适的原始载体，例如表达载体pmal-c2x、pet32a、pet28a，所述表达载体可以引导外源基因cwggpps在原核细胞如大肠杆菌中表达。pmal-c2x质粒带有mbp可溶性标签，有利于cwggpps蛋白在细菌体内可溶性表达及分离；为完成菌体内cwggpps蛋白的催化反应，可选择pet32a，本发明并不局限于此。

9、本发明提供了一种基因工程菌，菌体内包含如上所述的重组质粒。本发明中可以根据使用目的选择合适的微生物宿主细胞，所述菌体可以为但不限于原核生物大肠杆菌、真核生物酵母等。具体的，大肠杆菌可以采用e.coli bl21(de3)、e.coli bl21star(de3)、e.coli bw25113、e.coli jm109(de3)、e.coli bl21 txb(de3)等。

10、本发明中可以通过构建基因工程菌异源合成具有催化活性的温郁金源香叶基香叶基焦磷酸合酶，也可以构建具有萜类物质合成途径的基因工程菌，利用合成生物学策略实现菌体内cwggpps催化生产ggpp。

11、进一步的，宿主细胞内具有甲羟戊酸途径和甲基赤藓醇4-磷酸途径。例如大肠杆菌中天然具有mep途径；也可以利用基因工程技术手段在宿主细胞中引入外源mva途径，以提高菌株中底物法尼基焦磷酸(fpp)的产量，用于cwggpps的催化反应。

12、进一步的，宿主细胞内含有pbba5c-mevt(co)-t1-mbis(co,ispa)质粒。该质粒为公众可获得的商业化质粒，通过导入质粒在宿主细胞中引入mva途径。

13、本发明还提供了所述的温郁金来源的香叶基香叶基焦磷酸合酶基因在催化合成香叶基香叶基焦磷酸中的应用。

14、所述应用包括：以法尼基焦磷酸和异戊烯基焦磷酸为底物，在所述基因表达的香叶基香叶基焦磷酸合酶作用下，制备香叶基香叶基焦磷酸。

15、作为本发明的一种具体实施方式，利用含有重组表达质粒的基因工程菌诱导cwggpps蛋白合成，分离获得cwggpps蛋白，催化底物法尼基焦磷酸(fpp)和异戊烯基焦磷酸(ipp)，在体外合成香叶基香叶基焦磷酸(ggpp)。

16、进一步的，所述香叶基香叶基焦磷酸合酶的制备方法包括以下步骤：

17、1)将核苷酸序列如seq id no.1所示的基因片段克隆到pmal-c2x的酶切位点处，构建得到重组表达质粒pmal-cwggpps；

18、2)将重组表达质粒pmal-cwggpps转化至大肠杆菌中，获得基因工程菌，扩大培养后加入诱导剂诱导表达；

19、3)诱导结束后，收集菌体，加入酶促缓冲液重悬后超声破碎，然后离心取上清液，分离获得香叶基香叶基焦磷酸合酶。

20、作为本发明的一种具体实施方式，将所述重组表达质粒导入具有异源mva途径的工程菌株中，诱导表达cwggpps酶，菌株内催化底物fpp合成香叶基香叶基焦磷酸(ggpp)。

21、进一步的，所述应用包括以下步骤：

22、(1)将核苷酸序列如seq id no.1所示的基因片段克隆到pet32a载体的酶切位点处，构建得到重组表达质粒pet32a-cwggpps；

23、(2)将重组表达质粒pet32a-cwggpps和质粒pbba5c-mevt(co)-t1-mbis(co,ispa)转化至大肠杆菌中，获得基因工程菌，扩大培养后加入诱导剂诱导表达，并加入正十二烷覆盖于菌液液面；

24、(3)诱导结束后，取发酵液离心，取有机相正十二烷层，分离获得香叶基香叶基焦磷酸。

25、作为本发明的一种具体实施方式，根据本发明公开的基因cwggpps培育合成萜类的植物，也属于本发明的保护范围。

26、本发明具备的有益效果：

27、本发明从温郁金中克隆出一种香叶基香叶基焦磷酸合酶的编码基因cwggpps，该酶可以在生物体外，以法尼基焦磷酸(fpp)和异戊烯基焦磷酸(ipp)为底物制备香叶基香叶基焦磷酸；也可以在生物体内应用于以fpp和ipp为底物催化合成香叶基香叶基焦磷酸的通路，该技术可以用于后续通过微生物细胞工厂生产香叶基香叶基焦磷酸，为满足市场对萜类的需求提供有效方法。同时，利用本发明提供的cwggpps可以通过基因工程技术提高温郁金萜类物质的含量。