一种低产泡能力的解脂耶氏酵母菌株及其应用的制作方法

本发明属于生物合成，涉及一种低产泡能力的解脂耶氏酵母菌株及其应用，具体涉及发酵产泡沫能力显著降低的解脂耶氏酵母菌的获取与筛选方法及用于合成赤藓糖醇的方法。

背景技术：

1、随着合成生物技术的发展，对底盘菌株的要求越来越高，这些要求包括：耐受性(如耐受高渗透压以及耐受高温、耐受酸性环境等)、抗污染性、低泡性等。但是目前人们普遍更关注对环境的耐受性，而对是否低泡性并没有太多的关注，认为通过添加消泡剂即能有效解决。但是，即使通过添加消泡剂能抑制泡沫的产生，但是仍然存在以下问题：消泡剂会抑制底盘菌生长；消泡剂会增加发酵成本；消泡剂会增加分离成本；消泡剂还增加污染机会。而且，合成生物底盘发酵产泡沫是发酵领域遇到的共性问题，该问题的解决对提高发酵性能，降低发酵成本具有重要的意义。

2、解脂耶氏酵母菌是一种常用的合成生物学底盘菌株，也是合成功能糖醇如赤藓糖醇、甘露醇、阿拉伯糖醇等糖醇的天然菌株(cheng et al.,2018,microbial cellfactories,17:133；bilal et al.,2020,critical reviews in food science andnutrition,61(4):535-552)，也是合成其它产物如萜类化合物的工程菌株(ma et al,2019.advances in the metabolic engineering of yarrowia lipolytica for theproduction of terpenoids.bioresource technology,281,449–456.https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.02.116)，但在发酵合成产物的过程中会产生大量的泡沫，需要添加消泡剂以消除泡沫。发酵过程中产生泡沫具有以下缺点：(1)大量的泡沫降低发酵罐的有效使用体积；(2)大量的泡沫可能导致发酵液溢罐与染菌；(3)产生的泡沫降低发酵液的溶氧，降低发酵产量以及产物合成效率。

3、为了消除泡沫，就需要向发酵液中添加消泡剂或者对发酵罐进行改造，使得其具备一定的消泡机械装置。发酵添加的消泡剂包括聚醚型消泡剂与聚硅氧烷型消泡剂，均为化学合成消泡剂。化学合成消泡剂的加入虽然能消除一定的泡沫，但是带来的有害之处包括：(1)增加发酵成本、(2)抑制微生物的生长、(3)增加发酵液的粘度、(4)降低溶氧、(5)增加分离难度、(6)产品粘附消泡剂降低产品品质。通过增加机械消泡的装置会增加设备投资成本，而且消泡能力也是很有限的。因此，对菌株进行改良，从本质上减少或消除泡沫的产生，才是最主要的，这对于发酵领域具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决现有的解脂耶氏酵母菌发酵合成赤藓糖醇的不足之处，即在发酵过程中会产生大量的泡沫这一严重的缺点，提供一种低产泡能力的解脂耶氏酵母菌株及其应用。通过对现有的菌株进行多种协同诱变改造，对大量的突变菌株进行筛选，获得了一株低产泡能力的解脂耶氏酵母菌突变株；并采用该工程突变菌株直接发酵葡萄糖合成与纯化赤藓糖醇。

2、具体而言，本发明通过多种诱变的方法对基因组进行突变，将原有的合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母进行改良，使得该酵母能够利用葡萄糖等碳源高效合成赤藓糖醇，而且不产生泡沫或者产泡沫的能力显著减低；对获得的工程菌株进行多种筛选，获得产泡性能大幅降低的菌株。更具体来说，是以合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母为出发菌株，该酵母底盘英文名为yarrowia lipolytica，之前也称为candida lipolytica(如参考文献bankaretal.2009.environmental and industrial applications ofyarrowialipolytica.appl microbiol biotechnol,84:847–865)，根据翻译不同，中文翻译名可以为：解脂耶氏酵母、解脂酵母、解脂亚罗威酵母、亚罗威解脂酵母、解脂耶罗维亚酵母、解脂假丝酵母、假丝解脂酵母等。对此酵母底盘进行诱变操作，改变其基因组，获得不产生泡沫或者产泡沫的能力显著减低的工程菌株，并进行优选，获得一系列产泡性能降低或者不再产生泡沫的解脂耶氏酵母菌株。本发明还提供采用获得的菌株由葡萄糖等碳源发酵合成与纯化赤藓糖醇的方法。

3、本发明的目的可以通过以下方案来实现：

4、第一方面，本发明提供一种低产泡能力的解脂耶氏酵母菌株，所述菌株为解脂耶罗维亚酵母yarrowia lipolytica，保藏编号为cgmcc no.31031。

5、本发明通过多种诱变与筛选，最终获得一株产泡能力相对于出发菌株cgmccno.7326显著降低，在同等发酵条件下，消泡剂的添加量为对照菌株的三分之一及以下；同时合成产物赤藓糖醇有所提高的突变株cgmcc no.31031，该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为解脂耶罗维亚酵母yarrowialipolytica，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2024年06月21日，保存编号为cgmcc no.31031。

6、第二方面，本发明提供一种低产泡能力的解脂耶氏酵母菌株，是通过包括以下步骤的协同诱变方法获得：

7、s1、将如seq id no.1所示的dna转座子序列转化感受态解脂耶氏酵母，筛选获得转座子诱变菌株；

8、s2、将转座子诱变菌株进行artp诱变，筛选获得artp诱变菌株；

9、s3、将artp诱变菌株进行化学诱变，筛选获得低产泡能力的解脂耶氏酵母菌株。

10、本发明对合成赤藓糖醇的野生解脂耶氏酵母菌cgmcc no.7326进行多种诱变，改变基因组中的dna，即突变基因组，经筛选以获得不产泡或者产泡能力降低的解脂耶氏酵母菌株。由于微生物底盘菌株细胞数目巨大(如一次性对10亿左右的细胞进行诱变)，虽然多数诱变为不利突变，有利突变仅占很少的比例，但由于受到诱变的细胞数目巨大，即使只有百万分之一的有利突变，其有利突变株的数目仍然很多(10亿个细胞，假设一百万分之一的有利突变，即产生约1000个有利突变株)。采用该方法诱变获得的菌株在发酵过程中产泡沫性能显著降低，且该菌株仍能合成赤藓糖醇。

11、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，所述解脂耶氏酵母的保藏编号为cgmccno.7326。

12、本发明中，菌株cgmcc no.7326，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为解脂亚罗酵母yarrowialipolytica blc13，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2013年3月19日，保存编号为cgmcc no.7326。

13、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，所述转化的方法采用醋酸锂热激的方法。

14、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，dna转座子序列中，1-360bp序列为转座子上游序列；361-2660bp为霉酚酸筛选标记基因元件；2661-3614bp为转座子上游序列。

15、作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，所述筛选的方法包括：将转化后的感受态解脂耶氏酵母在含霉酚酸的固体基本培养基中培养，选取产泡最低的菌株，即转座子诱变菌株。

16、作为本发明的一个实施方案，步骤s1或s2或s3中，筛选出产泡最低的菌株。

17、本发明所采用转座子诱变的方法，利用解脂耶氏酵母菌非同源重组占优势的特点，以长末端重复序列作为同源臂(long terminal repeat,ltr)，上下游同源臂之间插入筛选标记(霉酚酸筛选标记基因)，构建成一段转座子序列，序列为seq no.1。以该序列转化合成赤藓糖醇的酵母菌株cgmcc no.7326，转化后在含霉酚酸的固体基本培养基中培养3-5天，得到的转化子逐一在丰富培养基中培养，从众多转化子中选择产泡明显降低的转化子，再进一步进行其它方式的诱变。详细的说明请见实施例1。

18、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述artp诱变为常压常温等离子体诱变。

19、进一步地，所述artp诱变采用artp诱变仪，artp诱变仪内腔用紫外线杀菌10-30分钟，在同一功率下设置8种诱变时间，第一个设置成10秒，每5秒增加梯度。

20、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，筛选产泡最低的菌株作为artp诱变菌株。

21、本发明所采用的artp诱变的方法。artp(atmospheric and room temperatureplasma)为常压常温等离子体诱变的方法。能够在常压常温下激发产生具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、oh自由基等)浓度的等离子体射流，作用于酵母菌细胞核dna，以产生dna变异。由于artp上述特性，其在微生物突变育种及生物医学领域中已经引起人们越来越多的重视。等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁或细胞膜的结构及通透性改变，并引起dna结构变化，进而使微生物基因序列及其代谢网络发生多种变化，导致微生物基因组产生突变。与传统诱变方法相比，采用artp能够有效造成dna多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株；与分子操作手段相比，artp进行微生物诱变育种具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点。因此，该方法的使用在微生物品种改良选育上非常普遍。本发明在上述(1)获得的产泡降低的突变株的基础上，再采用artp的诱变方法进一步诱变，再筛选，以获得产泡沫能力进一步降低的突变株。也可以进行多轮artp诱变，以选择得到产泡沫能力更低的突变株。详细的说明请见实施例2。

22、作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述化学诱变包括：使用化学诱变剂处理artp诱变菌株。

23、进一步地，所述化学诱变采用的化学诱变剂包括碱基类似物、烷化剂、移码诱变剂如硫酸二乙酯(dfs)、甲基磺酸乙酯(ems)、5-溴尿嘧啶(5-bu)、氮芥(nm)、n'广甲基n'亚硝基胍(ntg)中的一种或多种。

24、进一步地，所述处理的方法包括浸渍法、涂抹法、滴液法、注射法、施入法、熏蒸法中的一种。

25、作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，筛选产泡最低的菌株作为低产泡能力的解脂耶氏酵母菌株。

26、本发明所采用的化学诱变的方法。使用化学诱变剂，如碱基类似物、烷化剂、移码诱变剂、硫酸二乙酯(dfs)、甲基磺酸乙酯(ems)、5-溴尿嘧啶(5-bu)、氮芥(nm)、n'广甲基n'亚硝基胍(ntg)等，通过浸渍法、涂抹法、滴液法、注射法、施入法和熏蒸法等方式处理生物体，以诱导基因突变。本发明使用具有移码功能的化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ems)来进一步处理上述(2)获得的突变体，对获得的可能的突变体在丰富培养基中培养，筛选产泡能力进一步降低的突变株。也可以进行多轮化学诱变，以选择得到产泡沫能力更低的突变株。详细的说明请见实施例3。

27、采用上述三种协同诱变方法得到的菌株，除了进行发酵产泡沫性能的测试，同时还需要对合成产物赤藓糖醇的能力进行测定。选取产泡显著降低，同时合成赤藓糖醇能力有所提高的突变株。对于产泡沫虽然有显著降低，但是合成产物赤藓糖醇降低的突变株，则舍弃不用。目的是通过多种突变，以得到产泡沫显著降低，同时合成产物赤藓糖醇有提高的突变株。具体的发酵数据详见实施例1-3。

28、上述筛选是在250毫升摇瓶中进行发酵培养，以验证突变株的产泡性能是否降低，合成产物能力是否提高。为了进一步验证是否具备应用价值，在中试发酵罐中进一步发酵测试，验证是否在中试发酵罐中仍然产泡性能降低或者不产泡。中试发酵罐可以是3-50升容量的发酵罐，也可以是其它容量更大的发酵罐如200升体积，50立方体积发酵罐。

29、第三方面，本发明提供一种所述解脂耶氏酵母菌株在合成赤藓糖醇中的应用。

30、第四方面，本发明提供一种利用所述低产泡能力的解脂耶氏酵母菌株发酵合成赤藓糖醇的方法，包括以下步骤：

31、步骤一、将低产泡能力的解脂耶氏酵母菌株在培养基中进行通风发酵培养，发酵结束后菌液分离得到富含赤藓糖醇的发酵液；

32、步骤二、从富含赤藓糖醇的发酵液中分离纯化得到赤藓糖醇。

33、作为本发明的一个实施方案，步骤一中，所述培养基中的碳源包括葡萄糖、果糖、甘油中的一种或几种，所述碳源含量为220～355克/升。优选280-330克/升。最优选300克/升。

34、作为本发明的一个实施方案，步骤一中，所述培养基中的氮源包括酵母浸粉、酵母浸膏、蛋白胨、玉米浆干粉、磷酸氢二铵、柠檬酸铵、氨基酸中的一种或几种的混合，所述培养基中氮源含量为10～25克/升。优选10-18克/升。最优选14克/升。

35、作为本发明的一个实施方案，步骤一中，所述培养基还包括水。

36、作为本发明的一个实施方案，步骤一中，所述发酵培养的ph值为3.0～7.5，温度为3033℃。发酵培养通过振荡或者搅拌进行。

37、作为本发明的一个实施方案，步骤一中，培养过程中根据需要，添加少量的消泡剂或者不添加消泡剂。发酵培养过程中，每隔一段时间取样检测原料碳源如葡萄糖的剩余量与产物赤藓糖醇的生成量，当碳源如葡萄糖消耗完后停止发酵。

38、作为本发明的一个实施方案，步骤一中，所述菌液分离包括：采用离心或者膜过滤菌液分离方法分离去除菌体，将菌体漂洗后合并发酵液(将菌体加入水漂洗两次或以上以充分回收其中的赤藓糖醇)，得到澄清含赤藓糖醇的发酵液，浓缩得到富含赤藓糖醇浓缩液。

39、作为本发明的一个实施方案，步骤二中，所述分离纯化包括：将富含赤藓糖醇的发酵液进行一次结晶得到赤藓糖醇粗制品，再经粗品重溶、离子交换去除离子、脱色、浓缩、二次结晶得到赤藓糖醇精制品、干燥。

40、与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：

41、1、本发明提供的低产泡能力的解脂耶氏酵母菌株，由葡萄糖发酵合成赤藓糖醇的过程中泡沫少，能够提高发酵罐的有效利用率，如利用产泡沫的菌株，在100立方米体积的发酵罐中只能装入60立方体积或更少的发酵液，而利用本发明提供的不产泡沫或者产泡沫明显降低的菌株，则可以装入70立方甚至更多体积的发酵液，装入更多的发酵液能得到更多的产物赤藓糖醇。

42、2、使用本发明得到的不产泡沫或者产泡沫明显降低的菌株，在整个发酵过程中消泡剂的用量大大降低，减少了消泡剂的成本，并且在不同发酵条件(例如发酵培养体积、ph、温度、高糖浓度等)下均能稳定维持低泡的性能；同时能够高效合成赤藓糖醇，提高赤藓糖醇的产量，发酵液中最高230克/升的赤藓糖醇，并且其纯度达到99.9％及以上，具有实际使用的价值。

43、3、消泡剂粘附在结晶体表面会降低产品的品质，若晶体表面没有清洗干净，就容易使得产品容易成块，不利于后续加工使用。但使用本发明得到的不产泡沫或者产泡沫明显降低的菌株，由于消泡剂的使用量减少还能降低发酵液的粘度，发酵结束后菌液能更容易分离，并且产品赤藓糖醇结晶体表面粘附的消泡剂要减少。