水稻转录因子OsRAV1基因在调控种子耐贮性和萌发期耐盐性中的应用

本发明属于植物分子生物学和植物育种领域，具体涉及水稻转录因子 osrav1基因在调控种子耐贮性和萌发期耐盐性中的应用。

背景技术：

1、水稻种子活力与种子贮藏条件等因素密切相关，很大程度上决定了幼苗生长状况及对逆境的耐受性。在种子贮藏过程中的高温和高湿环境会导致种子活力下降，表现为发芽率降低、幼苗生长异常等现象，且对逆境耐受性降低。沿海地区水稻直播技术推广过程主要面临盐渍胁迫，对种子发芽和幼苗建成产生负面影响。

2、提升种子活力是提升作物生产力和适应性的关键策略之一。然而，目前水稻中克隆的调控种子活力相关基因较少，分子机制也不清楚。此外，种子萌发、耐贮性和萌发过程耐盐性之间存在关联性，如利用基因启动子或编码区的不同等位变异来调控转录水平和蛋白活性，对提高或平衡种子萌发、耐贮性和萌发期耐盐性等具有重要的意义，相关研究为培育高种子活力的水稻品种提供优异种质资源。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供水稻转录因子 osrav1基因在调控种子耐贮性和萌发期耐盐性的应用。通过过表达和crispr/cas9技术活力不同表达水平 osrav1转基因材料，发现 osrav1过表达材料可以提高种子贮藏后种子活力、直播条件下种子的成苗率及耐盐性，这为培育适宜直播的高种子活力的水稻提供了新的基因资源，这对耐贮藏、适宜直播和耐盐性的水稻品种选育具有重要意义。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供水稻转录因子 osrav1基因在调控水稻种子耐贮性和萌发期耐盐性中的应用。

4、所述调控水稻萌发期耐盐性为提高水稻盐胁迫条件下水稻种子的发芽率及水稻萌芽期的成苗率、根长、芽长、根干重和芽干重。

5、本发明还提供水稻转录因子 osrav1基因在调控水稻直播出苗率中的应用。

6、优选的，所述的 osrav1基因的核酸序列如seq id no.1所示；编码的氨基酸序列如seq id no.11所示。

7、本发明还提供一种调控水稻种子活力的方法，在水稻中过表达转录因子 osrav1基因，获得转基因水稻植株并得到高种子活力的水稻品种，所述水稻转录因子 osrav1基因的核酸序列如seq id no.1所示。

8、优选的，所述调控水稻种子活力为提高水稻种子活力。

9、优选的，所述调控水稻种子活力为提高老化处理后水稻种子的发芽速率和最终发芽率。

10、优选的，所述调控水稻种子活力为提高盐胁迫条件下水稻种子的发芽率及提高盐胁迫状态下水稻萌芽期的成苗率、根长、芽长、根干重和芽干重。

11、优选的，所述获得转基因水稻植株包括：将带有osrav1编码区片段的质粒转化农杆菌eha105感受态细胞，侵染水稻种子愈伤组织，通过潮霉素筛选获得转基因水稻植株。

12、优选的，所述转基因水稻植株的鉴定引物如seq id no.2~5所示。

13、一种调控水稻种子活力的方法，所述方法包括在水稻中过表达转录因子 osrav1基因，从而提高种子活力。利用crispr/cas9基因编辑技术，获得水稻 osrav1基因的敲除转基因水稻植株，其种子活力就会降低，所述水稻转录因子 osrav1基因的核酸序列如seq idno.1所示。

14、水稻中过量表达表达 osrav1基因的方法，包括如下步骤：

15、（1）以日本晴cdna为模板，设计同源重组引物，利用高保真酶扩增 osrav1编码区序列；

16、（2）将（1）中获得的纯化产物，克隆到pb1301ubinos-osrav1-3ha载体，获得重组质粒；

17、（3）将（2）带有 osrav1编码区片段的质粒转化农杆菌 eha105感受态细胞，侵染水稻种子愈伤组织，通过潮霉素筛选获得转基因水稻植株；

18、（4）步骤（3）中引物序列为:

19、hm-f: gcttctgcgggcgatttgtgt（seq id no.2）

20、hm -r: ggtcgcggaggctatggatgc（seq id no.3）

21、（5）利用qrt-pcr鉴定转基因植株，引物为 osrav1-f: gtggagccgattcgtgagggag（seq idno.4）， osrav1-r: cgtcgacggttgccaggttgtt（seq idno.5）

22、水稻中敲除 osrav1基因的方法，包括如下步骤：

23、靶向敲除水稻转录因子 osrav1基因的方法，采用crispr/cas9基因编辑技术，选取 osrav1基因的靶点序列以及相应的上游引物和下游引物，先后构建中间载体和最终载体；将最终载体侵染水稻愈伤组织，获得水稻 osrav1基因的敲除转基因水稻植株，即完成水稻 osrav1基因的靶向敲除。

24、（1）所述的靶点序列为 osrav1基因的第一外显子上的一段长度为20np的片段，靶点序列为gctcgtccacggacaagctg（seq id no.6）。

25、（2）所述上游引物的核苷酸序列为ggacatccgtccgtactggggtag（seq id no.7），所述下游引物的核苷酸序列为aaacgcttcggtatgacgagcctg（seq id no.8）。

26、（3）中间载体的构建方法包括以下步骤：1.利用限制性内切酶aari对中间载体sk-grna进行酶切；2.将上下游引物等比例混合后，100℃变性5分钟，室温冷却后形成带有粘性末端的片段；3.通过t4连接酶，将酶切后的sk-grna载体和带有粘性末端的片段进行连接，转化大肠杆菌 dh5α感受态细胞，得到含有目标片段的中间载体sk-grna- osrav1。

27、（4）最终载体的构建方法包括以下步骤：1.利用限制性内切酶 kpni和 bamhi对最终载体 pc1300-cas9进行酶切，形成带有粘性末端的载体；2.将上述步骤获得的中间载体sk-grna- osrav1用限制性内切酶 kpni和 bglii进行酶切，并回收片段；3.将带有粘性末端的pc1300-cas9载体和上述片段进行连接，转化大肠杆菌 dh5α感受态细胞，通过测序检测获得含有靶点序列的最终载体pc1300-cas9-grna- osrav1。

28、（5）将（4）构建成功的最终载体转化农杆菌 eha105感受态细胞，侵染水稻愈伤组织，通过潮霉素和pcr筛选获得转基因水稻植株。

29、（6） osrav1测序特异性引物 osrav1-f：atccgtccgtactggggtag；（seq id no.9）和 osrav1-r：gcttcggtatgacgagcctg（seq id no.10）。对上述转基因水稻植株进行测序筛选，最终获得了缺失5个碱基“acaag”的突变体株系 osrav1-1和插入1个碱基“g”的突变体株系 osrav1-2（图1）。

30、有益效果

31、本发明的 osrav1基因及其编码蛋白可用于调控水稻种子耐贮性和萌发期耐盐性。在种子经过人工老化处理后，过表达种子发芽率显著大于野生型，而敲除株系则相反。在ck处理中，过表达株系的根长和干重显著大于野生型；在0.5% nacl盐土处理中，两个过表达株系成苗率分别提高了68.54%和133.90%，根长、芽长、根干重和芽干重也显著大于野生型，而敲除株系则相反。因此，本发明可以用来解决种子贮藏后萌发活力下降的问题，提高水稻直播过程成苗率和盐胁迫耐受性，具有广阔的应用前景。