基于反转录转座子序列的黄精IRAP标记序列、试剂盒及用途

本发明属于分子生物学领域，尤其是一种从dna分子水平上对黄精种质进行鉴定的方法，涉及irap引物的开发、pcr扩增及irap标记的应用。基于反转录转座子序列开发的irap引物，专用于从dna水平对黄精种质进行快速鉴定及亲缘关系分析。

背景技术：

1、黄精(polygonatumsibiricum)，别称垂珠、野生姜、太阳草等，多年生草木植物，被誉为“血气双补之王”。黄精内含有多糖、生物碱、皂苷等多种化合物，能够抗脂肪肝、保护肾脏、抗阿尔兹海默症等。

2、黄精的鉴定方法主要包括形态学标记、细胞学标记、生化标记及分子标记。其中，分子标记以其快速、不受季节和环境限制、适用范围广等优点弥补了另外三种鉴定方法的不足。issr、rapd、scar等分子标记已在黄精遗传多样性分析、种质鉴定、系统发育等研究领域得到广泛的应用。

3、如在中国专利文献中，公开号为cn114164290a的发明专利披露了一种黄精issr-pcr分子标记方法，用于快速鉴定黄精种质资源。而叶碧欢等学者提出长梗黄精的scar分子鉴别方法，基于简单序列重复区间扩增多态性(issr)和相关序列扩增多态性(srap)分子标记对多花黄精与长梗黄精的基因组dna进行种间的多态性分析,获得issr和srap-pcr差异片段,经测序设计种特异性的特征性片段扩增区域(scar)引物,用于二种黄精属植物的准确快速鉴别(“长梗黄精的scar分子鉴别”，叶碧欢等，中国药学杂志，2019年)。

4、但以上分子标记尚有一些缺点，如：issr标记呈孟德尔遗传，难以区分显性纯合基因型和杂合基因型；rapd标记存在显性遗传问题，不能区分纯合型与杂合型，而且易受温度影响，从而导致试验的稳定性与重复性不佳；scar标记存在扩增位点单一，退火温度较高，对反应条件不敏感等问题。

5、反转录转座子是一种广泛存在于真核生物基因组中的可移动遗传因子，以rna为中间体，采用“复制-粘贴”的机制进行转座。反转录转座子主要有两类，一类是ltr，另一类是non-ltr。其中，ltr又可分为ty1-copia和ty3-gypsy两个类群，它们的主要区别是rt在其结构域中所处的位置不同。

6、ltr反转录转座子具有普遍性、拷贝数丰富、插入位点多态性等特点，故可以利用ltr反转录转座子开发分子标记，如irap、remap、ssap等。其中irap标记具有高通量、基因组覆盖范围广、多态性丰富等优点，已应用于遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图谱构建等方面。然而目前还没有将irap标记用于黄精种质鉴定的技术方案得到披露。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供基于反转录转座子序列的黄精irap标记序列、试剂盒及用途，以及与之相关的黄精种质鉴定方法。本发明基于黄精反转录转座子序列开发irap标记，利用该标记对黄精种质进行鉴定，为黄精优异种质的鉴别、保存、新种质挖掘等提供服务。

2、基于本发明的第一个主要方面，提供一种用于黄精种质鉴定的反转录转座子序列的irap标记引物，所述irap标记引物包括如下表1列出的一条或多条特异性引物：

3、表1irap引物序列表

4、

5、基于本发明的第二个主要方面，提供一种基于反转录转座子序列的irap标记黄精种质鉴定方法，该方法至少包括以下步骤：

6、s1，提取黄精基因组dna；

7、s2，基于黄精反转录转座子ty1-copia和ty3-gypsy的rt序列设计irap引物；

8、s3，选取不同种质的dna对irap引物按照pcr反应体系和pcr反应程序进行pcr反应扩增；

9、s4，通过琼脂糖凝胶电泳，对扩增后irap引物进行初步筛选，挑选多态性好且条带清晰的irap引物作为irap标记引物用于后续步骤；

10、s5，选择初步筛选的irap标记引物对所有供试材料进行irap标记分析，根据扩增条带的有无、多少及大小判定结果。

11、在以上步骤中，步骤s5中选择初步筛选的irap标记引物对供试材料种质按照与步骤s3相同的pcr反应体系和pcr反应程序进行pcr扩增，每条irap引物重复实验3次，并采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr反应产物。

12、作为进一步的优选方案，在步骤s3和步骤s5中，所述pcr反应体系为10μl体系：0.6μl模板dna，1.0μl引物，6.0μl pcr mix及2.4μl ddh2o。所述pcr反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共40次循环；72℃再反应10min，4℃保存。

13、作为一种优选的方案，基于黄精反转录转座子ty1-copia和ty3-gypsy的rt序列设计irap引物的过程包括以下几个步骤：

14、首先，通过对黄精ltr类反转录转座子rt序列进行克隆及测序，得到黄精反转录转座子ty1-copia和ty3-gypsy的序列信息；

15、使用序列比对软件，如blast，确定这些转座子序列的保守区域。通过多序列比对，识别ty1-copia和ty3-gypsy序列中的保守区域，这些区域可能作为设计引物的候选位点。

16、然后，利用引物设计软件，如primer3或oligo，根据保守序列设计irap引物。考虑引物的tm值、二聚体形成概率、引物对的特异性和覆盖度。

17、最后，使用体外合成的dna模板或基因组dna，通过pcr实验验证引物的特异性和扩增效率。对不同黄精种质样本进行irap-pcr扩增，筛选出具有良好多态性的引物组合。

18、作为可能的替代方案，可以使用高通量测序技术(如illumina或nanopore)对扩增片段进行测序，以提高鉴定的准确性和分辨率。或者利用crispr-cas系统对特定转座子序列进行编辑，以验证其在黄精基因组中的功能和作用。

19、在一些实施例中，包括开发或使用先进的生物信息学分析工具，如机器学习算法，以预测和解释转座子序列的多态性模式。通过实验优化irap-pcr的反应条件，如mg2+浓度、退火温度和循环次数，以提高扩增效率和特异性。作为进一步的优选方案，还包括收集并分析不同黄精种质的irap-pcr结果，建立一个包含标准谱带模式的数据库，用于后续的种质鉴定和比较；并将irap-pcr数据与其他分子标记数据集成，使用多变量统计分析方法，如主成分分析(pca)或聚类分析，以揭示黄精种质间的遗传关系。

20、作为本发明的第三个主要方面，提供一种用于执行前述方法的试剂盒，该试剂盒至少包含所述irap标记引物中的一条或多条引物，以及适合于irap-pcr反应的试剂。

21、在一些实施例中，该试剂盒包含所述irap标记引物中的一条或多条引物；以及

22、适合于irap-pcr反应的pcrmix；以及

23、用于dna扩增的ddh2o。

24、作为进一步的优选方案，所述适合于irap-pcr反应的pcrmix包括如下组成部分中的一份或者多份组合：dna聚合酶、dntps混合物、pcr缓冲液、mgcl2。

25、更进一步的，所述pcr缓冲液包含适当的盐、稳定剂和ph调节剂。

26、在一些实施例中，作为更进一步的优选方案，该试剂盒的一种制备方法包括如下步骤：

27、首先，根据提供的序列信息，使用高质量的dna合成服务来合成所有特定的irap标记引物。准备pcr缓冲液，包含适当的盐浓度、ph调节剂和稳定剂。准备dntps混合物，包含适量的四种去氧核苷酸三磷酸。选择合适的热稳定dna聚合酶，并根据制造商的说明确定其在pcrmix中的浓度。确定mgcl2的最佳浓度，并将其添加到pcrmix中。

28、再将pcrmix和ddh2o分装到适合的容器中，如pcr反应管或微量离心管。确保分装的体积与鉴定方法的需求一致，例如10μl体系。

29、然后将合成的irap标记引物按照所需的最终浓度稀释，并分装到单独的管中或预混合到pcrmix中。

30、在以上步骤中，需要对所有合成的引物和配制的pcrmix进行质量检测，确保它们的纯度和功能性。对分装好的试剂进行稳定性测试，确保在室温和冷藏条件下的稳定性。

31、最后将分装好的pcrmix、ddh2o、引物和使用说明书组装到一个便于运输和存储的试剂盒中。对完成的试剂盒进行最终的质量检验，确保所有组件均符合标准。

32、作为本发明的第四个主要方面，提供以上试剂盒的用途，所述试剂盒用于：黄精种质资源的鉴定，或黄精遗传多样性分析；其中

33、在黄精种质资源的鉴定的用途中，包括根据扩增条带的有无进行标记，即

34、在相同的电泳位置处有条带的标记为“1”，没有条带的标记为“0”，然后建立0/1数据矩阵，利用powermarkerv3.25软件计算多态信息含量pic，确定核心引物，利用获得的0/1数据矩阵，构建种质指纹代码；

35、最后通过条形码和二维码生成器构建供试种质电子身份证。

36、本发明的优点和有益效果：

37、本发明基于黄精反转录转座子序列开发irap标记，该标记操作方便、快速、结果稳定、效率高、不易受环境影响，可运用于各地区黄精种质鉴定、遗传多样性评价、物种亲缘关系分析等研究，为优异种质挖掘、辅助育种及种质产权保护提供有效手段。本发明需要解决的关键技术问题是获取高效的irap引物和确立pcr扩增体系。

38、具体来看，本发明相比现有技术至少具备以下突出的实质性特点和显著进步：

39、(1)操作简便快速：本发明利用基于黄精反转录转座子序列开发的irap引物，对样本进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳，即可得到检测结果。

40、(2)结果准确可靠：本发明从dna分子水平上，基于反转录转座子序列进行检测，并通过对数十种黄精种质进行检测，经多次重复的检测结果均保持一致，结果准确可靠；

41、(3)检测结果灵敏度高：对待检样品仅需提供30ng模板dna，即可准确鉴定其所属种质；

42、(4)多态性好：通过对数10种黄精种质进行检测，irap引物的多态性普遍较高，能高效鉴别不同的种质；

43、(5)确定了黄精irap-pcr的最优体系，经济、高效地利用irap标记对黄精种质进行鉴定；

44、(6)本发明基于黄精反转录转座子序列开发irap标记，可以有效的运用于各地区黄精种质鉴定、遗传多样性评价、物种亲缘关系分析等研究，为优异种质挖掘、辅助育种及种质产权保护提供有效的手段。