一种缺氧应答启动子元件及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种缺氧应答启动子元件及其应用。

背景技术：

1、人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,huc-msc)是指从新生儿脐带组织中分离获得的一种多功能干细胞，能向外界分泌多种细胞因子、多肽、外泌体等物质，起到调节免疫功能、促进器官修复的作用。由于huc-msc具有低免疫原性、不成瘤、安全性高等特点，目前正被开发成为治疗多种疾病的细胞药物，这些适应症包括脑卒中、冠心病、缺血性心力衰竭等重大缺血性疾病。

2、但是，这些缺血性疾病的受损组织/器官往往具有特殊的微观环境。以缺血性心衰为例，缺血性心衰指由于冠状动脉疾病引起的心肌坏死和纤维化，并导致严重左室功能障碍而引发的心力衰竭，缺血性心衰患者的心肌组织由于长期缺血，处于缺氧状态，这意味着到达病灶部位的huc-msc面临缺氧的微环境。

3、缺氧应答元件(hypoxia response element,hre)是一类位于启动子区域的dna序列，在低氧环境下，缺氧诱导因子能够结合这些序列并启动下游基因的表达。利用hre和缺氧诱导因子的特性，使huc-msc在缺氧环境下特异地高表达功能性蛋白，而在常氧环境中低表达或不表达这些蛋白成为可能，由此技术可以进一步延伸，通过构建包含缺氧应答启动子元件及特定基因的工程化huc-msc株，使其在缺氧的组织/器官中持续地分泌治疗性的蛋白/多肽，在常氧的组织/器官中低分泌或不分泌这些蛋白/多肽，达到有效、安全的双重目的。因此，这种启动子元件的识别是构建工程化huc-msc株的关键。在huc-msc中，对缺氧环境进行特异应答的启动子元件的识别鲜有报道。

技术实现思路

1、本发明在碳酸酐酶(carbon anhydrase ix)编码基因ca9的启动子基础上进行改造，创造了一种在huc-msc中对缺氧环境进行迅速应答的启动子元件，并利用该元件构建了一种在缺氧环境高表达nrg1活性多肽(nrg-1β2的第177-237位氨基酸的多肽)，在常氧环境中低表达nrg1活性多肽的工程化huc-msc株。

2、1、首次发现huc-msc中对缺氧环境快速响应的一系列基因，其中，ca9基因具有以下特点：(1)缺氧6小时其表达水平开始上调，并能持续上调，至缺氧72小时，其表达水平是对照组(常氧环境培养的huc-msc)的416倍；(2)ca9基因在常氧环境下基本不表达(或表达水平极低)；(3)ca9基因的启动子区域含有hre元件。

3、2、对ca9基因的启动子(ca9-wt)进行了改造，改造信息如表1。

4、表1

5、

6、3、双荧光素酶实验的结果显示，在缺氧环境中，ca9-4hre-ta的下游基因表达随着培养时间延长逐渐增加，且其表达水平显著高于ca9-wt和ca9-4hre的下游基因的表达水平；在常氧环境中，ca9-4hre-ta的下游基因表达随着培养时间延长基本不发生变化。

7、4、常用启动子(cmv、sv40、ef1α、hpgk1)的比较。双荧光素酶实验的结果显示，ca9-4hre-ta与在缺氧环境中，ca9-4hre-ta的下游基因表达随着培养时间延长逐渐增加，在缺氧24-72小时时，其下游基因表达与sv40、ef1α、hpgk1的下游基因的表达没有显著差异，但低于cmv的下游基因表达水平；在缺氧96小时时，ca9-4hre-ta的下游基因表达与cmv、sv40、ef1α、hpgk1的下游基因的表达没有显著差异。然而在常氧环境中，ca9-4hre-ta的下游基因表达在2、24、72、96小时时，均显著低于cmv和ef1α的下游基因表达水平。ca9-4hre-ta作为新发现的启动子，与常用启动子，有着同样的功能。

8、5、将ca9-4hre-ta与表达nrg1活性多肽(nrg-1β2的第177-237位氨基酸的多肽，后简称p61)的cdna组合，构建出可以根据氧气浓度调控表达p61的元件。将该元件利用基因组编辑技术敲入b2m基因的第二个外显子中，构建了一种在缺氧环境高表达p61，在常氧环境中低表达p61的工程化huc-msc株。

技术特征：

1.一种缺氧应答启动子元件，其特征在于，为基于ca9基因的启动子进行改造得到ca9-4hre或ca9-4hre-ta，其中，ca9-4hre的序列如seq id no.2所示，ca9-4hre-ta的序列如seqid no.3所示。

2.如权利要求1所述的缺氧应答启动子元件，其特征在于，所述的ca9-4hre是在ca9-wt序列中插入3个hre序列5’-tgcacgta-3’，并将-74nt的c突变为a得到。

3.如权利要求1所述的缺氧应答启动子元件，其特征在于，所述的ca9-4hre-ta是在ca9-wt序列中插入3个hre序列5’-tgcacgta-3’，并将-74nt的c突变为a，再将+30-+37nt的“5’-cacagtca-3’”变为“5’-tatatata-3’”得到。

4.权利要求1中的所述的缺氧应答启动子元件在显著提高缺氧环境下细胞中下游基因表达的应用。

5.一种缺氧环境下可高表达下游基因的细胞，其特征在于，含有如权利要求1所述的缺氧应答启动子元件。

6.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，通过缺氧应答启动子元件和质粒载体构建重组质粒，然后转染细胞获得。

7.一种缺氧环境下可高表达p61基因的huc-msc细胞株，其特征在于，通过如权利要求1中所述的缺氧应答启动子元件构建表达p61的重组质粒，将重组质粒转染脐带间充质干细胞，获得缺氧环境下高表达p61基因和和常氧环境下低表达p61基因的huc-msc细胞株。

8.如权利要求7所述的huc-msc细胞株，其特征在于，所述表达p61的重组质粒为b2m-ca9-4hre-ta-egfp-p61。

9.如权利要求7或8所述的huc-msc细胞株在制备治疗缺血性脑卒中、冠心病、缺血性心力衰竭的细胞药物中的应用。

技术总结本发明公开了一种缺氧应答启动子元件及其应用。该缺氧应答启动子元件是基于CA9基因的启动子进行改造得到CA9‑4HRE或CA9‑4HRE‑TA，其中，CA9‑4HRE的序列如SEQ ID NO.2所示，CA9‑4HRE‑TA的序列如SEQ ID NO.3所示。本发明在碳酸酐酶(carbon anhydrase IX)编码基因CA9的启动子基础上进行改造，创造了一种在hUC‑MSC中对缺氧环境进行迅速应答的启动子元件，并利用该元件构建了一种在缺氧环境高表达NRG1活性多肽，在常氧环境中低表达NRG1活性多肽的工程化hUC‑MSC株。技术研发人员：林彬,周丽诗,杨宋,高强,岑坚正,王萍,许恒,林先明,林泽斌受保护的技术使用者：佛山市中科律动生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4