一种鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量的SNP分子标记及其应用

本发明属于植物育种领域，具体涉及一种鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量的snp分子标记及其应用。背景技术：：：1、小麦(triticumaestivum l.)是我国最主要的粮食作物之一，为人类提供碳水化合物、蛋白质、膳食纤维、维生素和矿物质，其持续健康发展对保障我国粮食安全有重要意义。阿拉伯木聚糖(arabinoxylans,ax)作为小麦籽粒膳食纤维的主要成分，主要存在于小麦籽粒糊粉层中，根据水中溶解性差异分为水溶性阿拉伯木聚糖(water-extractablearabinoxylans,we-ax)和水不溶性阿拉伯木聚糖(water-unextractable arabinoxylans,wu-ax)两类，两者统称为总阿拉伯木聚糖(total arabinoxylans,tot-ax)。ax是小麦全麦品质的重要因素。另外，在加工品质方面，ax对磨粉品质和面团流变学特性、烘焙等加工品质具有重要作用；在生理功能方面，ax还可促进肠道有益菌生长、增强免疫系统活性、抗氧化及降低血糖水平等，显著增强人体免疫力。2、在小麦不同组织与品种(系)间，ax含量变异较大，受基因型显著影响，是多基因控制的数量性状，表明通过分子育种手段提高膳食纤维含量是可行的。随着小麦9k、50k、90k和660k芯片和二代测序技术的发展，snp标记得到广泛应用。然而，snp标记信息主要来源于芯片或重测序，成本过高难以大规模使用。利用小麦snp芯片的基因型数据进行qtl定位和gwas分析，将连锁snp转化为kasp标记，有助于高效、低成本和精准开展小麦复杂农艺性状mas育种工作。目前，利用qtl定位和gwas分析已鉴定到多个影响籽粒tot-ax和we-ax含量的qtl和关联位点。其中，位于1bl染色体的qtl在不同研究中均可稳定检测到，与该qtl紧密连锁的snp标记已成功开发为kasp标记并在不同研究中得到证实。因此，发掘影响ax含量的遗传位点，开发育种中可用的影响ax含量的kasp标记对小麦品质改良有重要意义。3、济麦22是高产、多抗、优质中筋小麦品种，累计推广面积超过2100万公顷，连续13年全国排名第一，适宜黄淮冬麦区北片和黄淮冬麦区南片的河南和安徽两省适宜区域种植。中麦578是高产、多抗、优质强筋小麦品种，品质与进口加麦相当，2020年创优质强筋麦高产纪录(841.5公斤/亩)，于2021年6月通过国家审定，适宜在黄淮冬麦区北片水地种植。中麦578和济麦22为中等ax含量品种，利用中麦578和济麦22构建了包括262个家系的重组自交系(ril)群体。技术实现思路1、本发明所要解决的问题是如何高通量鉴定或辅助鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量。2、为了解决以上技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量的方法，包括检测待测小麦基因组中snp位点的基因型，根据所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量，所述snp位点为小麦4d染色体上的一个位点，其核苷酸种类为a或g，为序列表中序列1的第36位核苷酸。3、所述基因型为aa或gg，所述aa是所述snp的核苷酸为a的纯合型，所述gg是所述snp的核苷酸为g的纯合型。所述snp的基因型为gg的待测小麦的阿拉伯木聚糖含量优于所述snp的基因型为aa的待测小麦。4、以小麦品种中国春参考基因组chinese spring refseq v1.0(https://urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/)序列为参考基因组，所述snp位点为小麦4d染色体96148463bp处(具体为序列表中序列1第36位)。5、作为一种实施方案，所述鉴定或辅助鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量的方法可包括如下步骤：6、(1)以待测小麦的基因组dna为模板，采用引物组合物进行kasp标记检测；所述引物组合物由引物a、引物b和引物c组成；7、所述引物a为核苷酸序列是序列表中序列2的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-42位的单链dna；8、所述引物b为核苷酸序列是序列表中序列3的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列3的第22-42位的单链dna；9、所述引物c为核苷酸序列是序列表中序列4的单链dna分子；10、(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测小麦的所述snp的基因型；11、(3)根据基因型结果进行鉴定待测小麦的阿拉伯木聚糖含量：所述snp的基因型为gg的待测小麦的阿拉伯木聚糖含量优于所述snp的基因型为aa的待测小麦。12、上述方法在小麦育种中的应用也属于本发明的保护范围。13、本发明还提供了检测小麦基因组中kasp的多态性或基因型的物质在如下任一中的应用：14、(1)鉴定或辅助鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量；15、(2)小麦育种；16、(3)制备鉴定或辅助鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量的产品；17、(4)制备小麦育种的产品；18、本发明还提供了小麦育种的方法。19、本发明所提供的小麦育种的方法，包括检测小麦基因组中所述snp位点的基因型，选择所述snp的基因型为gg的小麦作为亲本进行育种，所述gg是所述snp为g的纯合型。20、作为一种实施方法，小麦育种的方法可包括如下步骤：21、(1)以待测小麦的基因组dna为模板，采用上述引物组进行pcr扩增；22、(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测小麦所述snp位点的基因型；23、(3)选择gg基因型的小麦种质进行阿拉伯木聚糖含量高的优势小麦育种。24、上述方法中，引物溶解与配制方法可为：先将3条引物分别用ddh2o稀释成100μm，再按如下配制引物工作液：引物a12μl、引物b12μl、引物c 30μl、ddh2o46μl，作为kasp标记的引物工作液，-20℃保存备用。25、上述方法中，pcr的反应体系可为：2.0μl kasp 2×master mix(abclonal)、0.048μl kasp引物(3条引物混合，总浓度为50μm，其中两条上游引物a和b和下游引物c的摩尔比为2:2:5)和1.952μl模板dna(50ng/μl)，引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。上述方法中，pcr扩增可在高通量pcr仪上进行。扩增使用384孔pcr仪(bio-rad，s1000tmthermalcycler)。26、上述方法中，pcr的反应程序可为：27、第一步：94℃预变性15min；28、第二步：94℃变性20s、复性20s(第一次的复性温度为65℃，每个循环降温1℃)共10个循环；29、第三步：94℃变性20s、57℃复性1min共32个循环；30、上述方法中，确定待测小麦所述snp的基因型的方法可为：pcr反应完成后，利用自动聚焦荧光多功能酶标仪(pherastar plus,bmg labtech gmbh,德国)检测荧光信号，在klustercaller v3.4(lgc，hoddesdon,英国)进行基因分型。针对k_ax-110966723标记(snp位点ax-110966723)，a碱基类型带有fam荧光，分布于y轴附近；g碱基类型带有hex荧光，分布于x轴附近；无检出信号的样本分布于原点附近。31、本发明还提供了用于检测小麦基因组中snp位点的多态性或基因型的产品。32、本发明所提供的用于检测小麦基因组中所述snp位点的多态性或基因型的产品，含有上述检测小麦基因组中snp位点的多态性或基因型的物质，所述产品为任一种：33、c1)检测小麦阿拉伯木聚糖含量相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；34、c2)鉴定或辅助鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量的产品；35、c3)用于小麦育种的产品。36、上述应用、方法和产品中，所述物质可为通过下述至少一种方法确定所述snp位点的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白dna结合反应的芯片，及基于荧光分子dna结合反应的芯片。37、可选地，所述物质为如下d1)、d2)或d3)：38、d1)所述物质为扩增包括所述snp位点在内的小麦基因组dna片段的引物组合物；39、d2)所述物质为含有d1)所述引物组合物的pcr试剂；40、d3)所述物质为含有d1)所述引物组合物或d2)所述pcr试剂的试剂盒。41、可选地，所述扩增可为pcr扩增。所述引物组合物由所述引物a、所述引物b和所述引物c组成。42、d3)所述试剂盒还可包括kasp 2×master mix。43、上述应用、方法和产品中，所述引物组合物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。如所述引物组合物可为由核苷酸序列是序列表中序列2的第22-42位的单链dna、核苷酸序列是序列表中序列3的第22-42位的单链dna和核苷酸序列是序列表中序列4的单链dna组成的引物组合物，所述引物组合物也可为由序列表中序列2所示的单链dna、序列表中序列3所示的单链dna和由序列表中序列4所示的单链dna的引物组。序列表中序列2由42个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为fam序列(作为标记物)，第22-42位核苷酸为特异序列；序列表中序列3由42个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为hex序列(作为标记物)，第22-42位核苷酸为特异序列。44、本发明还提供了dna分子，核苷酸序列如序列表的序列1所示。45、上述的dna分子的应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用具体为在如下任一中的应用：46、(1)鉴定或辅助鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量；47、(2)小麦育种；48、(3)制备鉴定或辅助鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量的产品；49、(4)制备小麦育种的产品。50、可选地，在上述应用中，该dna分子作为检测靶标。51、可将检测所述snp位点多态性和基因型的物质与其他物质(如检测其他与小麦阿拉伯木聚糖含量相关的分子标记的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备鉴定小麦阿拉伯木聚糖含量的小麦品种的产品。52、本文中，所述育种的目的可包括培育高产小麦。所述小麦可为纯系或自交系。53、本文中，所述阿拉伯木聚糖含量包含水溶性阿拉伯木聚糖(water-extractablearabinoxylans,we-ax)和水不溶性阿拉伯木聚糖(water-unextractable arabinoxylans,wu-ax)两类。54、所述总阿拉伯木聚糖tot-ax和we-ax含量参考自cimmyt实验室hernandez-espinosa等(quantification of the total and water-extractable pentosan contentin wheat flour using a higher-throughput version of the phloroglucinolcolorimetric assay，2023)所述的间苯三酚-比色法测定。55、所述tot-ax含量(mg)＝(△asample-b)×v1×v2×1000÷(a×f×a1×a2)56、we-ax含量(mg)＝(△asample-b)×v1×1000÷(a×f×a1)57、△asample＝用于分析样品在552nm和510nm的吸光度差(a552-a510)58、a＝木糖标准曲线的斜率。该值根据曲线而变化；59、b＝木糖标准曲线的截距。该值根据曲线而变化；60、f＝用于分析的全麦面粉的质量(20mg)；61、v1＝用于提取阿拉伯木聚糖的体积(1000μl)；62、a1＝用于提取样品参与比色反应的体积(75μl)；63、v2＝用于在硫酸溶解步骤后稀释样品的体积(1800μl)；64、a2＝用于在硫酸溶解步骤后稀释样品的体积(300μl)；65、1000＝用于将结果从mg/mg转换为mg/g。66、本发明开发的kasp标记可有效用于筛选鉴定高小麦阿拉伯木聚糖含量的品种，也可用于聚合目标基因，提升后代株系中的小麦阿拉伯木聚糖含量，提升育种效率的同时减少因表型测定造成的成本。当前第1页12当前第1页12