肿瘤杀伤效应B细胞在结直肠癌肝转移的治疗和预后评估中的应用

本发明涉及肿瘤免疫治疗与预后评估领域，具体地说，是肿瘤杀伤效应b细胞在结直肠癌肝转移的治疗和预后评估中的应用。

背景技术：

1、肝转移是结直肠癌患者的主要死亡原因。手术切除转移灶是治疗转移肿瘤最彻底的治疗方式。然而，仅有20％-25％的患者可接受转移灶切除手术，多数患者因转移灶累及大血管或胆管，转移灶巨大或多发致切除后所剩肝脏功能不足以维持机体生存而无法耐受手术治疗。因此，以靶向和免疫治疗为主的肿瘤新辅助治疗成为目前治疗不能切除的结直肠癌肝转移的首选方法，目的是减轻肿瘤负荷，缩小肿瘤病灶，同时提供转化手术的机会。

2、从关注t细胞的嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell,car-t)免疫疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,tils)疗法，再到聚焦自然杀伤(nature killer,nk)细胞的nk细胞疗法，免疫细胞疗法已成为肿瘤免疫治疗的独特武器。然而，在免疫疗法的长期发展中，人体内最丰富的免疫细胞之一，b细胞，却被忽视了。既往研究发现，肿瘤浸润b细胞包括初始b细胞到记忆b细胞和终末分化浆细胞，在抗肿瘤反应中发挥着多方面的作用。经典的b细胞抗肿瘤机制包括：1.作为抗原加工和递呈细胞激活t细胞抗肿瘤免疫；2.产生肿瘤特异性抗体，介导补体级联反应和抗体依赖性细胞毒性来杀伤肿瘤细胞。本课题组新近研究发现，在结直肠癌肝转移灶中存在一群肿瘤杀伤效应b细胞，能够分泌颗粒酶gzma和gzmb效应分子，同时合成穿孔素蛋白1(pfr1)形成免疫突触间隙，介导gzma和gzmb进入肿瘤细胞内，直接诱导肿瘤细胞凋亡，而不是依赖t细胞的肿瘤杀伤功能。因此，此类b细胞具有潜在的抗肿瘤免疫治疗价值。

3、已有研究根据肿瘤组织中效应t细胞和nk细胞的浸润程度将实体肿瘤分为“热”肿瘤和“冷”肿瘤：“热”肿瘤组织中浸润大量cd8+杀伤t细胞和nk细胞，肿瘤tnm分期较低，预示着肿瘤预后较好；而“冷”肿瘤组织中效应t细胞和nk细胞稀少甚至缺失，常伴较高的tnm分期，提示肿瘤预后差。本课题组新近研究同样发现，结直肠癌肝转移组织中存在一群具有效应杀伤表型的肿瘤杀伤效应b细胞，其浸润程度也与结直肠癌肝转移患者的预后呈正相关。因此，这群细胞在肝转移灶中的浸润程度可作为预测结直肠癌肝转移患者预后的病理学指标之一。值得进一步在临床实践中展开应用并验证。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供肿瘤杀伤效应b细胞在结直肠癌肝转移的治疗和预后评估中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明通过对人结直肠癌肝转移灶组织进行10×单细胞转录组测序，发现一群具有肿瘤效应杀伤表型的b淋巴细胞亚群，并命名为meta-cbl。通过免疫组化染色、流式细胞检测以及体外细胞功能实验均证实了meta-cbl存在于肝脏转移灶中，并通过促凋亡作用直接杀伤肿瘤细胞。细胞转录组功能分析以及体外细胞共培养实验均提示meta-cbl具有潜在的抗肿瘤治疗价值。

4、同时，本发明通过对大样本数据的预后分析发现在肝脏转移灶中meta-cbl细胞浸润程度与结直肠癌肝转移患者的疾病特异生存期(disease specific survival,dss)呈正相关。因此，meta-cbl可以作为评估结直肠癌肝转移患者预后的病理学指标之一。

5、基于上述技术方案，本发明的第一方面，提供检测肿瘤组织中meta-cbl的浸润程度的试剂在制备评估结直肠癌肝转移患者预后的试剂盒中的应用。

6、进一步地，所述的检测肿瘤组织中meta-cbl的浸润程度的试剂为检测结直肠癌肝转移组织中meta-cbl的浸润程度的试剂。

7、进一步地，所述的检测肿瘤组织中meta-cbl的浸润程度的试剂包括检测meta-cbl表型cd19、gzma、gzmb和pfr1的免疫组化试剂。

8、更近一步地，所述的检测转移灶组织中meta-cbl的浸润程度的方法：取肿瘤组织，应用多重荧光免疫组化染色试剂盒(五色，包括dapi，594，488，cy3，cy5通道)对meta-cbl细胞标记蛋白(cd19，gzma，gzmb，pfr1)，以及细胞核进行染色。应用imagej软件标记出共表达cd19+gzma+pfr1+和cd19+gzmb+pfr1+的细胞，并对cd19+gzma+pfr1+和cd19+gzmb+pfr1+的b细胞进行定量分析，作为meta-cbl在肿瘤灶中浸润程度的量化指标。

9、本发明的第二方面，提供一种评估结直肠癌肝转移患者预后的试剂盒，所述的试剂盒中包括检测肿瘤组织中meta-cbl的浸润程度的试剂。

10、进一步地，所述的试剂盒为检测meta-cbl表型cd19、gzma、gzmb和pfr1的免疫组化试剂盒，通过半定量转移灶中meta-cbl的浸润程度，评估患者的预后。

11、更近一步地，meta-cbl在结直肠癌肝转移组织中的浸润程度与结直肠癌肝转移患者的dss呈正相关，肿瘤组织中meta-cbl浸润越多，患者的预后越好。

12、本发明的第三方面，提供meta-cbl在制备治疗结直肠癌肝转移的细胞治疗药物中的应用。

13、进一步地，所述的meta-cbl特异性高表达gzma，gzmb和prf1效应分子。其中cd19+gzma+pfr1+细胞为gzma+meta-cbl；cd19+gzmb+pfr1+细胞为gzmb+meta-cbl。

14、基于患者组织样本检测和体外功能试验，本发明发现肝脏转移灶b细胞中约有20-30％属于meta-cbl亚群，转移灶b细胞体外诱导肿瘤细胞的凋亡能力显著高于其他组织定植的b细胞，诱导细胞凋亡的数目增加3.5倍，提示meta-cbl具有显著的杀伤肿瘤细胞的功能。同时，gsea分析推测meta-cbl对肿瘤细胞的杀伤功能是通过免疫突触(gzma/gzmb-prf1)介导的促凋亡功能。因此，可以将转移灶b细胞分离后，通过体外扩增meta-cbl，通过载体靶向导入或直接注射入肿瘤部位，达到消除肿瘤，减轻转移灶肿瘤负荷的目的。

15、本发明中：

16、效应淋巴细胞：淋巴细胞在抗原刺激下发生转化并不断增殖，形成的一群与清除抗原相关的特异性淋巴细胞。包括辅助性淋巴细胞，抑制性淋巴细胞和细胞毒性淋巴细胞。

17、细胞毒性淋巴细胞：一种特异性效应淋巴细胞，分泌各种细胞因子参与免疫作用，对某些病毒，肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用。目前认为细胞毒性淋巴细胞主要包括细胞毒性t淋巴细胞与自然杀伤细胞，构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。

18、颗粒酶a/b(gzma/gzmb)：外源性的丝氨酸蛋白酶，来自细胞毒性淋巴细胞和自然杀伤细胞释放的细胞浆颗粒，目前在人类中发现了5种颗粒酶(gmza，gmzb，gmzh，gmzk，gmzm)，其中以gmza和gzmb诱发细胞凋亡的活性最强。当细胞毒性淋巴细胞和靶细胞结合，颗粒酶进入靶细胞，和穿孔蛋白共同作用下激起靶细胞内的级联反应，引起靶细胞dna降解，然后裂解。

19、穿孔素1(pfr1)：细胞溶素，杀伤淋巴细胞胞浆颗粒释放出来，在靶细胞膜上形成空洞，与颗粒酶协同作用杀伤靶细胞。

20、本发明优点在于：

21、1、本发明首次通过10×单细胞测序检测结合体外验证实验发现并证实了一群具有杀伤效应的b细胞亚群meta-cbl，该群b细胞通过诱导凋亡机制直接杀伤肿瘤细胞。因此，meta-cbl具有潜在的杀伤肿瘤细胞的效应淋巴细胞功能，利用meta-cbl对肿瘤细胞的直接杀伤作用，可将组织中分离得到的meta-cbl通过体外诱导其增殖、扩增后注射入肿瘤组织内，或通过载体靶向肿瘤细胞，作为肿瘤b细胞治疗的新型方法之一。若与pd-1/pd-l1抑制剂联合应用，可全面诱导t、b细胞的联合抗肿瘤活性，提高pd-1/pd-l1抑制剂单药治疗的应答率，具有强大的抗肿瘤免疫治疗价值。

22、2、本发明通过大样本数分析，证实肝脏转移灶中meta-cbl细胞浸润程度与患者的dss呈正相关，因此，meta-cbl在肿瘤组织中浸润的程度可作为病理学上对结直肠癌肝转移患者的预后评估指标之一。